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水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究

作者2021-07-15 11:38未知
摘要
 
我国水稻秸秆资源丰富,年产量达3亿多吨。利用水稻秸秆生产燃料乙醇,对解决未来我国能源问题、实现节粮代粮和环保有着巨大的潜力和广阔的应用前景。水稻秸秆的主要成分是纤维素,对纤维素的利用最主要的限制性因素是将纤维素转化为可发酵还原搪。
解决的办法主要有两类途径:(l)提高纤维素酶生产的经济性,主要涉及纤维素酶高产菌的获得及纤维素酶的生产技术,提高其合成效率以降低单位纤维素酶生产成本;(2)提高纤维素酶利用效率,主要涉及纤维素酶解催化过程,以降低单位可发酵还原糖生产成本。因此,本研究从菌种的选育着手,研究了菌株的产酶特性,用响应面策略优化发酵培养基,形成了SL发酵罐分批发酵生产高活力纤维素酶技术;分离纯化了纤维素酶;构建了代谢纤维二糖的酿酒酵母工程菌;对酿酒酵母工程菌细胞固定化发酵进行了研究,利用二级串联式生物反应器祸合系统生物协同酶解水稻秸秆发酵生产燃料乙醇等。主要研究结果如下:
1.筛选到一株纤维素酶高产菌株 (PenicilliumYT01),原生质体紫外诱变后得到突变株YT02,YT02以水稻秸秆为碳源,豆饼粉和硫酸铵为氮源,在29℃,初始pH6.0发酵12Oh,纤维素酶活力达到最高,摇瓶发酵滤纸酶活(FPA)、CMC酶活(CMcase)和p-葡萄糖苷酶活(CB)分别达 3.86IU/mL、 207.41IU/mL和l.4oIU/mL。
2.用响应面方法(RSM)优化的发酵培养基组成为:水稻秸秆为 41.95g/l,豆饼粉为 24.83g/L,麸皮为22.16g/l,困H4)2504、KHZpO4为4g/L,MgSO;为0.sg/L;起始pH6.0。
以优化的培养基发酵120h,滤纸酶活、cMc酶活和β-葡萄糖苷酶活分别达到8.8967IU/mL、    357.41IU/mLand3.704IU/mL。远高于优化前的纤维素酶活水平。
3.在SL发酵罐中研究了温度、pH值和溶氧对菌体生长和产酶的影响,确定了分批发酵的工艺条件为:0一32h时发酵温度32℃,溶氧70%;32h至1加h发酵结果发酵温度 29℃,溶氧50%,发酵液初始pH值6.0,发酵%h滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活分别达到 11.13IU/mL、 465.24IU/mLand4.08IU/mL,均高于摇瓶发酵水平,分批发酵动力学过程显示,突变菌YT02菌体生长和纤维素酶各组分均为部分祸联。
4.利用 DEAEsephadexΑ-25和sephadexG-75分离纯化了二个内切葡聚糖酶 (CMCase)和一个β-葡萄糖苷酶,CMCase纯化倍数为13.48,回收率为10.54%,β-葡萄糖苷酶纯化倍数为18.62,回收率为8.62%,经SDS-PAGE得到单蛋白分子条带,经分子量测定分别为 73kDa、 43kDa和 57.8kDa,并对其进行了N端测序和质谱分析。
5.以生产乙醇性能优良的酿酒酵母菌株NAN-27作为工程菌株的受体菌。利用稳定性能良好的多拷贝整合型载体pYMIKP,使纤维二糖代谢基因BGLI整合到酿酒酵母的染色体上。从而在酿酒酵母工业菌株中建立了稳定的纤维二糖代谢途径,拓展了酒精生产的底物利用范围,降低了纤维二糖对纤维素酶解的抑制作用。采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌,固定化细胞与游离细胞相比,发酵时间缩短,乙醇产率提高20%以上,并能有效地利用水稻秸秆水解液进行酒精发酵。
6.对水稻秸秆酶解过程中底物性质、酶解温度、酶解pH、底物浓度及纤维素酶用量等关键因子进行了研究。由于YT02纤维素酶系中纤维二搪酶活力较低(CB/F队为0.38),经稀酸稀碱预处理后的水稻秸秆纤维素对乙醇转化率仅为18%。采用代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌游离细胞发酵,可部分去除纤维二糖对酶解的抑制,水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可提高至20%。进一步利用采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌发酵,水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可达26%。这方面的研究结果有助于深入了解纤维素酶的协同降解机制。
7.将纤维原料的酶解、固定化代谢纤维二搪酿酒酵母工程菌的作用有机祸联,构建成新型的二级串联式生物反应器,在该反应器体系的协同作用下,可有效解除纤维二糖和葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用,促进纤维原料水稻秸秆的酶水解,发酵40h,乙醇浓度达25.5g/l,纤维素对乙醇的转化率达43.0%(纤维素对乙醇的理论转化率为56.61%),是游离细胞同时糖化发酵(SSF)的 1.65倍,生产效率达0.64留(Lh)。采用分批添料式协同酶解发酵工艺,可提高纤维底物的终浓度达250g/L,产物乙醇的终浓度66.51g/l,有效提高了纤维素酶的利用率和乙醇生产效率,降低乙醇的生产成本。该反应器性能稳定,反应效率高,固定化细胞可以重复使用,便于自动化控制。
关键词:纤维素酶,水稻秸秆,酿酒酵母,燃料乙醇,串联式生物反应器


第一章文献综述

随着全球经济的快速发展,化石燃料日趋减少,寻找新的替代能源己迫在眉睫。燃料乙醇作为一种清洁能源,正成为潜在的替代能源之一。将可再生的生物资源通过生物化学方法进行转化是制取燃料乙醇的重要途径。
全世界水稻秸秆年产量为6亿多吨,我国是农业大国,水稻秸秆资源十分丰富,年产量达3亿吨,是巨大的可再生资源。然而随着我国农村生活水平的提高,水稻秸秆作为劣质燃料被煤或电取代、作为肥料被化肥取代、作为耕牛食草被农业机械取代,因此,水稻秸秆作为传统意义上的燃料、肥料和饲料被排除于农业生产的内部循环之外,逐步演变成无用的负担物,大部分就地焚烧,严重污染了生态环境。水稻秸秆的主要结构成分是纤维素,约占水稻秸秆干重的40%,为多糖聚合物,利用纤维素酶可将水稻秸秆纤维素资源转化成葡萄糖,进一步用来生产燃料乙醇,把数量如此巨大的水稻秸秆纤维素转化为燃料乙醇对于解决我国能源问题和环境保护问题具有十分重要的意义。
目前,对纤维素利用的工艺流程中,最主要的问题存在于纤维素转化为可发酵的还原搪这一步。纤维素酶的催化效率较低,即便以纤维素酶催化非固体的梭甲基纤维素水解反应的转化数也不足淀粉酶催化固体淀粉水解反应的十分之一,而纤维素酶催化结晶纤维素水解反应的速率则更是与之差了2~3个数量级,但是考虑到环境与应用的问题,以纤维素酶催化纤维素的糖化水解,仍然是纤维素最理想的处理方式。由于纤维素酶催化效率低,所以纤维素糖化的成本中,纤维素酶所占比例较大。因此,降低单位还原糖的生产成本的策略有两种:(1)提高纤维素酶生产的经济性,降低单位纤维素酶的生产成本:(2)提高纤维素酶的比活力或者利用效率,降低单位可发酵还原糖的成本。
围绕上述两个方向的理论研究以及工程学研究的不断发展,以选择具有人们期望的特性的纤维素酶和菌株,是提高纤维素酶水解的基础;而生物学与工程学的过程整合为纤维素的高效降解提供了新思路。
1水稻秸秆资源及其降解方式
1.1水稻秸秆的组成与结构
水稻秸秆主要由纤维素(约为33%)、半纤维素(约为26%)和木质素(7%)组成,其外还有矿物质、角质和栓质等,是巨大的可再生资源。
纤维素(Cellulose)是水稻秸秆最主要的结构成分,是由D-吡喃葡萄糖基以β-1,4-糖普连接而成的天然的链状高分子化合物,见图1-1,完全水解后得到葡萄糖。分子式可表示为(C6H10O5)n,n为纤维素的聚合度。根据纤维素在特定条件下的溶解度,可以将纤维素分级为:α-纤维素、β-纤维素和γ-纤维素。α-纤维素聚合度大于200,β-纤维素聚合度为10~200左右,γ-纤维素聚合度小于10。α-纤维素含量用于表示纤维素的纯度,指20℃下不溶于17.5%或18%NaoH溶液的纤维素部分,而将萃取碱液用醋酸中和后沉淀出的部分定义为β-纤维素,残留在中和溶液中未沉淀部分定义为γ-纤维素。

维素的结构也较复杂,但基本上是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是山15-40根有结晶部和非结晶部构成的纤维分子长链。纤维素的结晶部分是由纤维索分子进行非常整齐规则地折叠排列而成的。在结晶部分里,葡萄糖分子的轻基或在分子内部或与分子外部的氢离子相结合,没有游离的轻基存在,所以纤维素分子具有牢固的结晶构造,酶分子及水分子难以侵入到内部中。因此,纤维素的结晶部分t匕非结晶部分难分解得多。
半纤维素(HemieeUulose)是水稻秸秆的另一主要组分,是一大类结构不同的带有支链的多聚糖的总称。在许多情况下,半纤维素分子不是由一个单一的糖普聚合而成,而是由2-6个不同的糖昔组成。其结构单元包括戊糖基,己糖基,糖酸基和乙酸基。其中戊糖主要为木糖和阿拉糖。在细胞壁中,它位于许多纤维素之间,就象一种充填在纤维素框架中的填充料。半纤维素与纤维素不同,它很容易被水解。但是由于半纤维素和纤维素交杂在一起,所以只有当纤维素也被水解时,半纤维素才可能全部水解。
木质素(Ligin)是水稻秸秆中含量较少的有机高聚物。是具有网状空间结构的高分子芳香族化合物,由丙苯基单元(C6-C3)通过醚键和碳碳键连接而成的。木质素大多以粉状形式存在,聚合度n一般为150~200。它和半纤维素一起作为细胞间质填充在细胞壁的微细纤维之间,加固木化组织的细胞壁:它也存在于细胞间层,把相邻的细胞粘结在一起。木质素虽然对纤维素的酶解反应没有损害作用,但它和半纤维素形成牢固的结合层,紧紧地包围着纤维素,阻碍酶与纤维素的接触,从而降低反应速率。因而植物纤维素如果除去其中的半纤维素和木质素,增大孔隙结构,将有利于纤维素的降解。
1.2水稻秸秆的预处理
由于木质素、半纤维素对纤维素的保护作用以及纤维素本身的结晶结构,天然纤维质原料直接进行水解时,其水解程度是很低的。因此为了提高糖化速度,必需对纤维素进行一定的预处理。预处理的主要作用是改变天然纤维的结构,降低纤维素的结晶,脱去木质素,增加酶与纤维素的接触面积,从而提高酶解的效率。预处理的方法主要有物理,化学,生物、氨冷冻和蒸汽爆破法。
1.2.1物理方法预处理水稻秸秆
机械粉碎是纤维原料预处理的常用方法,它能使颗粒变小,降低洁净度,对处理高结晶度和高度木质化的材料都有较高的容积密度,有利于增加酶反应的底物浓度,提高酶的作用效率。粉碎处理的方法中,以球磨尤其是震荡球磨的效率更高,高温下研磨比在低温下研磨的效果更好,如果研磨时加入少量膨胀剂或木质素溶剂亦可以提高研磨的效果。
另外,蒸汽爆破法也研究得较为深入,蒸爆处理  (steamExPlosionPr℃ess)这种方法是将水稻秸秆原料先用200~240℃的水蒸气处理适当时间 (30sec~ 200min),在蒸煮的过程中发生水解反应,然后连同水蒸气一起从反应釜中急速放出突然降压而爆破,内含水闪蒸时产生巨大的爆破力、摩擦力与碰撞力,使纤维原料被破碎。结果使得半纤维索分解为溶于水的低聚物。蒸爆处理后纤维素和半纤维素都有不同程度的分解,但半纤维素分解较多,因而水洗后物料中的纤维素含量相对有所增加。而木质素在处理后小分子化,经过水洗,这部分已分解的成会进入水洗液,因而造成物料中木质素的含量降低。
木质素因烯丙键断裂而生成的分子物质,有相当一部分可溶解在有机溶剂和稀碱中,由于木质素,半纤维素结合层被破坏,使得纤维素易被降解利用。该方法的不足之处是设备的要求高,能耗大,在高温条件下由于部分木糖的变性会产生糠醛等有害物质。
1.2.2化学方法预处理水稻秸秆
通常采用酸、碱、次氯酸钠、臭氧等试剂进行预处理,其中以氢氧化钠和稀酸预处理研究得较多。
碱预处理操作简便,设备要求较低,用碱处理天然纤维素材料可显著提高酶解效率。常用氢氧化钠和石灰,氢氧化钠可以使分子间键皂化,脱去木质素,促进膨胀,因此是一种膨胀剂。氢氧化钠处理可使约85%的半纤维素和约65%的木质素被降解,因而有较强的脱木质素和降低结晶度的作用。但是碱处理的主要缺点在于氢氧化钠成本较高且不易回收,产生的废液会造成环境污染;另外,碱处理后的半纤维素不是以单糖而是以大分子的形式进入溶液,不能被微生物利用,因而这部分的半纤维素被浪费了。而且这种处理能耗较大,所以不太适用于大规模生产。
稀酸处理通常采用0.3~1.2%的H2504,在110~220℃下处理一定时间,由于半纤维素被水解成单糖,残余物形成多孔或溶涨型结构,从而促进了酶水解,有利于资源的充分利用,但木质素依然保留在固体残渣中,对后续步骤会有一定的不良影响。稀酸处理可以使绝大部分的半纤维素被降解,以单糖(木糖)的形式进入溶液中,而纤维素和木质素则基本留在固体物料中。所以经处理后,剩余物料中半纤维素含量显著减少,而纤维素和木质素的相对含量有所增加。稀酸处理还可使纤维素的平均聚合度下降,反应能力增大,有利于酶解的进行。此外,稀酸处理后所得的处理液中含有大量的木糖,可用来进行微生物发酵转化为其他产品,因而这部分被降解的半纤维素也可以得到经济合理的运用。与氢氧化钠相比,氨的成本相对较低,若采用适宜的方法可以实现氨的循环使用。而且氨处理去除木质素的效果相对较好,经处理后约50~55%的木质素被脱除,同时半纤维素也去除了一部分。由于在纤维物料酶水解过程中,木质素能阻止酶分子对纤维素的进攻,从机时降低了反应速率,而适当浓度的氨可脱去大部分木质素但保留大部分半纤维素,这样既可消除酶解的主要障碍,以能使纤维素和半纤维素得到充分利用。
1.2.3生物方法预处理水稻秸秆
近年来,关于选择分解木质素的微生物或酶进行天然纤维素预处理的研究比较多,木材腐败菌能使木质素分子的侧链氧化和芳香环氧化裂解。也可能通过甲氧基的脱甲基或芳香环的直接轻化,使芳香环断裂。
由白腐菌产生的木质素分解酶类主要有木质素过氧化物酶,锰过氧化物酶和漆酶,利用这类真菌可以降解纤维原料中的木质素,从而提高纤维素的酶解效率。利用分离的酶进行预处理比直接利用微生物更加困难,因为无细胞的木质素降解酶可能是酶和辅酶的复杂的混合物。
生物预处理方法条件温和,能耗低,无污染,但通常处理的时间周期较长,而且许多白腐真菌在分解木质素的同时也消耗部分纤维素。采用基因工程技术对白腐菌进行遗传改良,将有助于拓展生物方法预处理的实际应用。
 1.3水稻秸秆纤维素的降解方式
水稻秸秆纤维素大分子之间,纤维素和水分子之间,以及纤维素大分子内部都会形成大量氢键。氢键作用远远强于范德华力,而纤维素的聚合度非常大,所以纤维素分子间的氢键力非常巨大,并因此决定了纤维素的多种特性:自组装性、结晶性、形成原纤的多相结构、吸水性、可及性和化学活性等各种特定性质。纤维素的结构特点是其水解速率的限制因素,包括结晶度  (erystaillinityIndeX,erl)、聚合度 (Degreeofpolymerization)和可及性(Acoessibility)等方面。另外,半纤维素和木质素对纤维素的包被作用,纤维素表面的平整度、纤维素的结晶形态等多种因素对纤维素的酶解效率都有显著的影响。
1.3.1水稻秸秆的酸水解
酸水解就是利用水稻秸秆纤维素大分子中的β-1,4-糖普键,它是一种竣醛键,对酸特别敏感,在适当的氢离子浓度、温度和作用时间下,可以使糖营键断裂、聚合度下降、还原能力提高,完全水解生成葡萄糖127]。酸水解最大的优点是水解完全、反应速率快、_I二艺成熟,但由于酸水解要消耗大量的酸、对反应设备腐蚀性大、能耗高、条件苛刻,同时产生大量的酸废水,环境污染严重。酸水解主要有浓酸水解与稀酸水解二种方法。纤维素在浓酸中的水解是均相水解。是纤维素晶体结构在酸中润胀或溶解后,通过形成酸的复合物,再水解成低聚糖和葡萄糖。过程如下:
纤维素--------酸复合物-------低聚糖-------葡萄搪
浓酸催化纤维素分解的机理是:酸在水中解离并产生氢离子,当纤维素链上的β-1,4糖普健和水合氢离子接触时,后者将一个氢离子交给β-1,4-糖营健上的氧,使这个氧变得不稳定。当氧键断裂时,与水反应生成两个轻基,并重新放出氢离子,后者可再次参与催化水解反应。在一定的酸浓度范围内,纤维素水解反应的速度与酸的浓度呈正比。温度增加酸水解反应的速度也会加快,一般认为,温度增加10℃,水解速度提高1.2倍。
纤维素在稀酸中水解属多相水解,水解发生于固相纤维素和稀酸溶液之间。在高温高压下,稀酸可将纤维素完全水解成葡萄糖:
纤维素-------水解纤维素------可溶性多糖--------葡萄糖
在纤维素水解的同时也会发生葡萄糖的回聚现象,葡萄糖的回聚是纤维素水解的逆过程,水解溶液中单糖和酸的浓度越大,回聚程度越大。葡萄糖回聚后可以生成二糖或三聚糖。因此为了提高葡萄糖的得率,在水解末期,必须将溶液稀释和加热,使回聚的低聚糖再次水解。
1.3.2水稻秸秆的酶水解
尽管自1910年人们便开始采用浓酸对植物纤维素进行水解,但由于强酸对设备的腐蚀、对环境所造成污染及强酸回收利用等问题得不到很好的解决,一直没有大的发展。而植物纤维素的酶水解反应条件温和,对设备基本无腐蚀,环境友好,水解产物对于发酵生产燃料乙醇抑制作用较弱,得到很快的发展。水稻秸秆的酶水解在整个水稻秸秆原料生产燃料乙醇成本中占60%左右,控制水稻秸秆的酶水解成本,在由水稻秸秆原料生产燃料乙醇工业化过程中,起着非常重要的作用。
影响水稻秸秆纤维素酶水解的因素主要包括底物、纤维素酶和酶解操作过程。一方面是底物的结构,预处理改变水稻秸秆纤维素的可及度、结晶度、木质素和半纤维素的含量及与纤维素的结合方式,这就说明选择合适的预处理方法非常重要,另一方面是底物的浓度,浓度过高对酶水解有抑制作用,浓度过低则水解效率低,所得还原糖浓度低而无工业应用价值。纤维素酶是影响酶水解成本与水解效率的关键因素,由于不同的微生物会产生不同酶系的纤维素酶,对水稻秸秆纤维素原料的水解能力也不同,因此根据底物的组成与结构选用合适的纤维素酶至关重要,在必要时采用来源于不同微生物的纤维素酶构成复合酶制剂;另外,酶的用量决定酶水解的成本与经济的可行性,合适的酶浓度是纤维素酶水解所必需的。纤维素酶解操作过程包括生物反应器和酶解条件,如温度、pH值、底物浓度、酶用量等,其在酶水解过程中非常重要。
提高水稻秸秆纤维素酶解效率与降低水解成本主要有以下途径:
(l)筛选高产纤维素酶生产菌株,或采用基因工程方法构建高产纤维素酶基因工程菌,选取合适的发酵方法和发酵条件,以降低纤维素酶的生产成本。
(2)在酶水解过程中采用合适酶复合制剂或协同水解反应器,减少纤维二糖等中间产物及半纤维素水解产物对酶水解过程的抑制作用,使纤维素酶不同组分更好地协同作用。
(3)对纤维素酶进行固定化,以便纤维素酶的重复利用,从而降低水稻秸秆原料的酶水解成本。
(4)为了有效地消除产物抑制,水解还原糖从酶水解系统通过超滤移出,或采用同步发酵及时将生成的还原糖消耗掉。
2纤维素酶的性质与用途
2.1纤维素酶的多酶体系
纤维素酶的发现比较早,相关研究也较多。纤维素酶是指能够水解纤维素β-l,4葡萄糖昔键,生成葡萄糖和纤维二糖的一组酶的总称。它不是单一酶,而是一种多组分的复合酶系。现已确定纤维素酶含有三种主要组分:从广义的角度分,纤维素酶系包括水解酶类、氧化酶类和磷酸化酶类137]。从狭义上分,一般认为真菌的纤维素酶系(cellulase:ystem)由三类不同但又互补的酶组成[38],分别为:内切葡聚糖酶(l,4-β-D- glucan glucanhydrolase或endo-l,4-β-D-glucanase,Ee3.2.l.4,来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen)或称为Cx酶,这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区,随机水解β-1,4-糖普键,产生大量的有非还原端的小分子纤维素,主要是纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖,由于它并不是单一组分,而是包括多个组分,组分数又随菌株而异,又称Cx。又因大都用梭甲基纤维素(CMC)为底物测定其活力,故又称CMC酶或CMCase。EG专一性不强,对水溶性纤维素都有作用,取代基对酶活性影响不大;外切β-纤维二糖水解酶(β-1,4-D-glucaneellobiohydrolase或exo-l,4-β-D-glueanase,EC3.2.l.4,来自真菌的简称为CBH,来自细菌的简称为Cex)相当于Reese假说中的Cl酶,这类酶主要作用于纤维素线状分子的末端,水解β-1,4糖普键,每次切下一个纤维二糖分子,此类外切酶单独作用于天然纤维素时,几乎检测不出还原糖的生成,对取代基纤维素也只是微弱作用,但与内切葡聚糖酶协同作用则可有效地分解天然纤维素。CBH可降解纤维寡糖,但其降解能力随纤维寡糖链的缩短而下降,专一性强;β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC3.2.1.21,也称BG或纤维二糖酶),它的作用是水解纤维二糖及低分子量的纤维寡搪然后生成葡萄搪,该酶对其底物特异性并不是很高,特别是很多非纤维素微生物也能产生大量这类组分。把这些组分按不同的比例组合进行分解天然纤维素实验,可以看到各组分单独作用时效果较差,而协同作用时表现出很强的分解活性。除上述三大组分外,可能参与纤维素降解过程的酶还有纤维二糖脱氢酶、纤维二糖醒氧化还原酶、磷酸化酶和纤维素酶小体。纤维素分子自身的复杂结构决定了纤维素酶系的复杂性,只有纤维素酶系各组分之间充分发挥协同作用,才可以最终把纤维索分子降解成葡萄搪。
2.2纤维素酶的分子结构
纤维素酶结构与功能的研究相对于纤维素酶的其他方面,起步较晚。十几年来随着各种现代化结构分析技术的应用,使得我们能够在酶分子的氨基酸顺序结构和三维结构__匕开展研究。借助现代化分析技术和方法如重组DNA、电镜和X射线扫描、作用位点修饰诱变、局部蛋白水解、亲和色谱分离、在特性和配合体结合研究方面的人工基质的采用等,己经取得了较大的进展。
纤维素酶分子的一级结构都具有类似的结构,即由球状的催化结构域(CatalyticDomain,CD)通过一个富含脯氨酸或轻基氨基酸的连接桥Linker(链接区)和没有催化作用纤维素结合结构域  (CelluloseBindingDomhans,CBD)三部分组成,形成现在为大家所熟悉的蜡蚌蝌蚪状结构 (图1-2)。
 
纤维素酶分子的催化结构域(CD),主要体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。不同功能的纤维素酶各组分在纤维素分解过程中普遍存在协同作用。一般地外切酶的活性位点位于一个长环状通道中,它作用于不溶性纤维表面,使形成结晶结构的纤维素长分子链开裂,长链分子末端发生部分游离,从而使纤维素易于水解,它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖;内切酶的活性位点位于一个开放的裂口中,它作用于经外切酶活化的纤维素,分解其β-1,4-葡萄糖昔键产生二糖、三糖等短链低聚搪,它可结合在纤维素链的任何部位并切断纤维素链,β-葡萄糖苷酶再将纤维二糖、三糖等分解成葡萄糖。
值得一提的是,该协同作用不但其作用顺序不是绝对的,就是各酶的功能也不是简单固定的。钟发刚等研究表明EG和CBH都能引起纤维素的分散和脱纤化(沿着纤维素的轴方向分层,形成更薄更细的亚纤维)。这样,纤维素的结晶结构被打乱,导致变形,使纤维素酶能够深入到纤维素分子界面之间,从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙壁的压力增大,水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏,产生部分可溶性的微结晶利于进一步降解。
纤维素结合结构域(CBD)在纤维素酶中位于肤链的氨基端或梭基端,通过连接桥与催化结构域相连。纤维素结合结构域不具备水解纤维素的功能,但有助于纤维素酶与底物的结合,CBD执行着调节纤维素酶对可溶性纤维素和不溶性纤维素专一性活力的作用,它也具有分离纤维素的作用。它的三维结构极为复杂,对酶的催化活力起决定作用。真菌的CBD由33~36个氨基酸组成,且具有高度的同源(约79%),而细菌纤酶的CBD由100~110个氨基酸组成,同源性低。真菌T,resei的外切酶的结构解析表明,它的CBD形状呈“楔形”,一面亲水,另一面疏水,结构中芳香族氨基酸有三个保守的Tyr残基,它们位于平坦的亲水面。CBD一面亲水、一面疏水的锲形结构,使它能插入和分开纤维素的结晶,通过芳香族氨基酸上的芳香环和葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上,在其吸附于纤维素分子链表面后,酶分子连接到纤维素上,提高了底物表面有效酶的浓度,或者可能促进了纤维素表面单.个葡聚糖链的增溶溶解,具有疏解纤维素链的作用,以利于催化区的水解。但有一些纤维素酶并没有CBD,如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小体吸附纤维素的。不同的CBD以不同的拓扑学结构与结晶纤维素结合,都具有相似的刚性支柱结构,以便进行识别和结合所需的侧链能正确定位。
连接桥是一段相当长、高度糖基化的连接肤,此区大多富含脯氨酸和轻脯氨酸,它的作用可能是保持CD和CBD之间的距离,有助于酶分子之间形成较为稳定的聚集体。.这-段肤链因为暴露于水相而对蛋白酶非常敏感,所以为了防止被蛋白酶水解,这一段肤链常常被O-glycosilated糖基化。细菌纤维素酶的linker:富含Pho和Thr,而真菌纤维素酶的linker:富含Gly、ser和Thr。
2.3纤维素酶的作用机理
在水稻秸秆纤维素的酶水解过程中,目前普遍认为是纤维素酶三种组分协同作用的结果。协同理论认为纤维素酶系降解纤维素是内切葡聚糖酶(EG)、外切纤维素酶(CBH)和葡萄糖苷酶(BG)相互协同作用的结果。协同作用降解模型(图1-3)是目前最为广泛接受的酶水解机理。
 
内切葡聚糖酶对结晶纤维素(如棉花和微晶纤维素)无活性,但可水解非结晶纤维素和可溶性底物如梭甲基纤维素钠,纤维低聚糖也是其底物,其水解速率随链的延长而加快。内切葡聚糖酶首先进攻纤维素的非结晶区,形成外切纤维素酶需要的新的游离末端,然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位,一般来说,单独的EG或CBH都不能有效酶解天然纤维素,而对具有高结晶度的天然纤维素,如棉花等则必须有内、外切酶的协同作用。几乎所有的β-葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差,能够裂解C-O糖营键、C-S键、C-N键和C-F键等;有些对糖基部分的C4和C6位的专一性也不高。但在所有的底物中,β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的活性最强。这些酶随机作用于β-葡萄糖昔键,大量释放还原糖,迅速降低底物聚合度,充分显示了三种纤维素酶组分对不同基质有着不同的水解作用能力。但一般地说,协同作用与酶解底物的结晶度成正比,当酶组分的混合比例与霉菌发酵滤液中各组分比相近时,协同性最大,不同菌源的内切与外切酶之间也具有协同作用。
原初反应假说认为原初反应即无序化反应(Amorphogenesis)使纤维素的结晶状态改变,而便于随后各种纤维素酶(EG,CBH,GE)的水解作用。小分子的非酶试剂与起初纤维素的解聚有一定关系。而短纤维形成理论认为在酶解初期形成短纤维,这对纤维素的降解起着非常重要的作用。
纤维底物结构上的特征在一定程度上决定了它对酶水解的倾向性。这些特征包括酶可接触的表面积,纤维结晶度和聚合度,木质素的含量,底物的浓度等,这些是影响纤维素降解的主要因素。同时,与酶相关的一些因素也会影响纤维素的降解,包括纤维素酶系的构成、酶解产物(纤维二糖与葡萄糖)对纤维素酶的反馈抑制、酶在水解过程中由于温度、机械力或化学力的作用而造成部分失活等。为缓解这些不利影响,提高酶解效率,对纤维底物进行适当的预处理、选择合理的底物浓度是行之有效的方法;增加纤维素酶的用量、补充高活力的纤维二糖酶也可以大大提高葡萄糖的得率,但其代价是增加了酶解成本;另外,进行底物的同步糖化发酵等,也是增加酶解得率的有效途径。
2.4纤维素酶的分子量大小
纤维素酶的分子范围很广。一般Cx的分子量介于 23kDa~ 146kDa之间,CI的分子量介于  38kDa~ll8kDa之间。微生物等各种生物体内所得到的纤维素酶,其基本的结构性质有所差别。目前从微生物酶液中分离纯化获得的内切和外切β-葡聚糖酶分子量从 30kDa到100kDa变化不等。如Yoon,M.H.等153】从  Cellulomonas sP.CSl-1发酵液中分离到二个β-葡萄糖苷酶,其分子量分别为50KDa and52KDa。Ogura,J.等从Lysobacter,sp.IB-9374的培养液中分离纯到一个β-葡萄糖苷酶,其分子量为 41kDa。Yoon,J.J.等从Fomitopsis palustris的酶液中分离到二个内切葡聚糖酶,其分子量分别为 47kDa和 35kDa。Naika, G.S.等从 Aspergillus aculeatus中分离纯化了一个内切葡聚糖酶,其分子量为 45kDa。Lee,Y.J.等从Bacillus。Amyloliquefacien:发酵液中分离纯化得到一个纤维素酶,分子量为 54kDa。该酶具有水解CMC、纤维二糖和葡聚糖的能力,其最适作用温度和pH值分别为 50℃和pH7.0。一般来说,β-葡萄糖苷酶相对分子量为  90kDa~l00kDa(胞内酶)和 47kDa~76kDa(胞外酶)。不同的菌株产生的β-葡萄糖苷酶由于其结构和组成不同,其性质是不一样的,即使是同一菌株也可能产生不同的β-葡萄糖苷酶,而其可能是单亚基、双亚基或者多亚基的。
纤维素酶相对分子量的差异,据 TuM.等1581研究认为:多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化影响,所含碳水化合物的比率不同在很大程度上决定了酶的多型性,根本上表现为分子量的差异。
2.5纤维素酶的最适反应条件与稳定性
曲霉、青霉及木霉等真菌产生的酶蛋白一般为酸性酶,在酸性环境中有较高的酶活,其最适反应pH值一般都在3.0一6.0的酸性范围内,最适温度为40一60℃,嗜热真菌的最适温度为60℃左右159!,β-葡萄糖苷酶的最适温度在40一110℃之间都有分布。大部分细菌纤维素酶的最适pH值为中性或碱性。
纤维素酶各组分的热稳定性也不同,如康氏木霉的Cx酶的热稳定性比较好,而Cl酶和纤维二糖酶的热稳定性比较差。余玮等【60]报道的粗壮脉纹饱菌(NeurosPor。。ra.\’s“)所产纤维素酶最适催化反应温度为45一50℃,酶的活性在60一70℃时酶活力明显F降,但是进一步提高温度,酶的活力下降并不明显。从分子结构上看,内切葡聚糖酶的活性位点相对较少,其最适温度为50一60℃,而且热稳定性较好,在95℃时仍保留一定的酶活性。
CBH的最适反应温度一般为40一70℃,一些普通中温真菌的CBH的最适反应温度一般在45℃1611,纤维素酶的热稳定性还与反应pH有关,如粉红镰抱和康氏木霉的cl酶在pH4.0一8.0范围内热稳定性较好。拟康氏木霉的Cx酶在 pH2.0或7.0时,如温度在40℃以上,活力便开始降低;在  pH3.0或6.0时,当温度在50℃以上,活力开始降低;而在较适宜的 pH4.0与5.0之间时,温度超过60℃,酶活力才开始降低。
对于工业应用来说,酶的热稳定性越高越有利,因此,从嗜热细菌和嗜热真菌中分离β-葡萄糖苷酶逐渐引起人们的重视。对于嗜热微生物β-葡萄糖苷酶为何具有如此强烈的耐热稳定性还未有获得共识。据王冬梅等[62]对来自嗜热性和非嗜热性β-葡萄搪普酶的分析认为,二者在相互演化过程中发生的酶修饰作用虽然不改变酶的活性中心,也不改变其专一性,但是将酶蛋白结构作了部分调整,从而能够适应极端的高温环境。
2.6纤维素酶的应用
利用纤维素酶使大量纤维素资源和城市纤维素废料转变成人类生活所需要的物质,利用纤维素酶的催化反应代替高温高压的化学反应,对于实现节粮、代粮、降低成本和革新工艺等,具有积极深远的意义。到目前为止,纤维素酶己在食品加工、酿造工业、纺织品整理及印染、能源工业、饲料工业、洗涤剂工业、制药及环保等领域中得到了广泛的应用163}。尤其是在燃料乙醇生产产业上,对有效降低乙醇的生产成本,缓解能源危机潜力巨大。

3纤维素酶的生产

3.1纤维素酶的生产菌种选育

自然界中能降解纤维素酶的微生物非常多,自二十世纪六十年代以来,据不完全统计,国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约己经有53个属的几千个菌株。目前应用于纤维素酶生产的真菌主要有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(A明e馆illus)、青霉属(pinieillium)、镰抱菌属(Fusarium)、根霉属(Rhiz叩us)和漆斑霉属(协厂othecium)等;细菌有纤维素粘菌属(Celt℃℃cu、)和芽抱杆菌属(Bacillus)等;放线菌有链霉菌属(StrePtomy。、)和嗜热单抱菌属(Thermomon。胡。r。)等[“肠]。
真菌纤维素酶多分泌到生长培养基中,虽然各组分间不形成多酶复合体,但有着很强的协同作用,而其协同效果大于各组分单独作用效果之和。木霉属(Trich口derma)中的里氏木霉 (Treesei)是目前研究最多的纤维素降解菌,里氏木霉菌株的不足之处是尽管它们能产生高活力的Cl酶和Cx酶,但形成纤维二糖酶的能力较低。而许多曲霉属菌种,如黑曲霉(AsPe馆 illusnige;)、海藻曲霉 (A.Phoenicis)等,能产生高活力的纤维二糖酶。细菌产生的纤维素酶量少,多数的酶组分不能分泌到细胞外,而是通过胞内酶或细胞膜结合的形式发挥作用。故很少用细菌作纤维素酶的生产菌种。另外,酵母也可产生纤维素酶。实际上,自然界产生纤维素酶的菌株远不限于文献报道的已知种属,这与自然界存在丰富的纤维素资源是相适应的。
要使纤维素酶真正能够用于工业生产,首先要降低纤维素酶的成本,选育高酶活性的纤维素分解菌株就成了关键之一。许多年来,国内外己经在产纤维素酶的微生物选育方面进行了广泛研究,使纤维素酶的来源有所拓宽,产酶微生物菌种日益增多。石家骥等从生霉材料中选育的康宁木霉(Trich口ndermako朋1911)既具有β-1,4-葡聚糖酶活性,又具有β-1,3-葡聚糖酶活性,非常适合用于啤酒生产工艺的改善。姚强等从碱性土壤中分离到产耐碱性纤维素酶的丝状真菌哈茨木霉(Trichoderm“harzianum)其所产内切酶在 pH7.0时活性最高, pH9.5活性还能保持40%以上。兰时乐等170】从腐木上分离到一株纤维素酶高产菌绿色木霉(Trich口derma,iride),经物理化学诱变处理后,固体发酵96一 120h,梭甲基纤维素酶(Carbox卿 ethyleellulase,CMCase)活性达2890oU,滤纸酶活(Filterp叩 eraetivity,F队)达604u。曾撤新等17’】从北极楚科奇海分离出一株产纤维素酶的耐冷假交替单胞菌,该菌所产纤维素酶最适作用温度35℃,5℃时酶活保留50%左右,25℃下酶活稳定,酶最适 pH8.0。王慧杰172】等从腐烂秸秆、长期堆积秸秆的土壤中分离到一株能够用于降解秸秆l2的纤维素酶产生菌康氏木霉,谢占玲等[73]自青海省东部森林分离到产纤维素酶性能优良的0143菌株康氏木霉(Trich口 dermakoningii),该菌经亚硝基肌诱变后,其固体发酵物FPA达20砰mol/min,可应用于饲料中,作为饲料用酶。Virunanon.C等从农业废料和牛粪中分离得到。ellutolyti。。tostridi。,该菌高产内切纤维素酶;Fujil.K等174]从桔子皮上分离得到一株青霉有望用于纤维素酶生产及农业废物的处理。江龙法等175]从白酒糟采集的样品中分离到纤维素酶活较高的5株菌,其分解分解滤纸的酶活力则最高达到 6.4U/mL。金显春等从烂玉米芯、农田的烂稻茬和麦茬分离得到对稻草降解较为完全的一株菌株,该菌株对纤维素降解率达72%。张建强等[77]从腐烂稻草、土壤和牛粪等样品中分离筛选出1株分解纤维素能力较强的脉纹饱菌 (NeurosPorasP.),该菌株的梭甲基纤维素酶活和滤纸酶活分别达到3551.1和386.7μmol/(g.h)。
利用物理、化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞或孢子是选育高产变种行之有效的方法,现在使用的许多高酶活菌株大多数都是通过该方法获得的。蔡勇等178]以一株产单组分梭甲基纤维素酶芽袍杆菌 BacillussP.CY123为出发菌,经紫外线和亚硝基肌复合诱变处理后,其纤维素酶产量达到了53.86u/mL,是出发菌株的4倍。李西波等!791用青霉(Penicillium胡.)HKZoo3为原始菌,经亚硝基肌(NTG)、轻胺复合诱变,根据变异菌株菌落形态变化与产酶高低的关系,结合酶活力检测理化指标,筛选出一株高产稳定的纤维素酶菌株Lx435,其产酶能力由Zoou/mL提高到415U/mL,较出发菌株提高2.05倍。杜娟等[801以一株具有较高纤维素酶活性的野生菌株灰绿曲霉XCg为出发菌株,经过紫外线、氯化铿、甲基磺酸乙醋(EMS)等物理化学诱变剂多重诱变处理,获得了抗葡萄糖阻遏的突变株EZ一26、ES一65、U6一31和EU7一22,其CMC酶活与出发菌株相比分别提高至 1.7、 1.4、 1.3、2.0倍。
常规诱变的方法存在着偶然性大,不能定向及工作量大等不足,近十多年来,细胞融合技术、基因重组技术、基因定位突变技术在纤维素酶菌株的构建上取得了可喜的进展。人们己从40多种细菌和数种真菌中克隆到了纤维素酶基因,同时构建了这些酶的基因文库,其中一些酶的基因已在大肠杆菌和酵母中得到了表达133,85一881。因此将己克隆到的基因同高效表达基因的启动子和染色体起始位点融合则可表达,且表达量增加;同时,利用基因工程手段对纤维素酶分子进行改造,使其活性提高,耐受性增强。由于瑞氏木霉产量高,同时瑞氏木霉可作为外源基因的表达系统,即作为新的基因工程受体菌。如将黑曲霉的纤维二糖酶基因在瑞氏木霉中表达,可提高纤维素酶活力;同时,利用基因失活技术控制不必要的酶活性,并调节某些酶的活性比例,此外,通过对有关启动子的研究,可根据需要进行调控。如删除调控葡萄糖阻遏作用的纤维素酶启动子的有关核苷酸片段,可保证在葡萄糖积累的情况下纤维素酶启动子的活性19’l。另外,故近些年已有了对这两个远属间的基因能否相容性遗传和表达的研究。艾云灿等192】通过改良常规方法成功地获得了两属间具有纤维素酶系杂种优势的稳定重组单体ATH- 1376,从而为降低产酶或菌体培养成本提供了新的途径。
纵观近十几年来的文献报道,纤维素酶研究领域相当活跃,尤其是近年来进展较快,但由于受菌种、酶蛋白本身的性质以及底物特性的限制,将纤维素酶用于纤维原料生物转化仍存在着成本偏高的问题。进一步优化产酶工艺,降低生产成本,选育和构建高产菌株,是实现纤维素酶工业化应用的主攻方向。

3.2纤维素酶的生产

纤维素酶的生产有固态发酵和液体深层发酵两种方法。固态发酵具有设备简单、投资少、易于推广等优点,但其发酵水平不稳定、生产效率低、容易污染杂菌、不适于大规模生产;而液体发酵因为其原料利用率高、劳动强度小、不易污染杂菌,生产效率高,生产条件比较容易控制、产酶质量稳定等优点而成为发酵生产纤维素酶的必然趋势。
液体深层发酵通常采用分批(Batch)、添料分批(Fed一bateh)或连续(Continuanee)培养方式生产纤维素酶。在分批发酵过程中,所有营养物一次加入发酵罐中,发酵罐必须重复定期清洗、灭菌、接种、发酵和收取酶液,该工艺便于控制培养条件,酶的产量高并有利于阻止杂菌的污染,是目前最为常用的一种方法。其缺点是周期长、生产效率低队!。在连续发酵工艺中,培养液既有流出,也有流入,发酵罐中培养液的体积和营养物的浓度保持恒定。采用该工艺能够获得更高的产酶效率,减少设备投资,降低产酶成本,但是不足之处是酶的浓度较低。尽管产酶成本明显降低,但用单位体积所含活力很低的稀酶液去水解纤维素材料,在经济上是不合算的,因为由此将得到葡萄搪浓度很低的水解液。
添料分批发酵(也叫半连续发酵)过程中补加一种或数种营养物到反应器中,但运转过程中培养液并不流出。这一产酶方式,在一定程度上综合了分批和连续发酵工艺的优点,采用分批添料技术,可以克服因发酵液中底物浓度过高或不足所带来的不良后果,有利于减少氧气和营养物质的扩散阻力,增加底物的总用量,从而促进酶活力和产率的提高。
影响液体发酵产酶的主要因素有:培养基成份,发酵温度,发酵液pH值,通风搅拌量等。发酵温度和pH对细胞内各种酶的活性有较大影响,从而可以引起微生物代谢途径发生变化。通风搅拌不仅决定了发酵液中溶氧量的大小,还决定了微生物细胞与营养底物的接触情况.除此之外,由于真菌纤维素酶可诱导和胞外酶的特点,诱导剂和表面活性剂的添加也可以对产酶起到一定的促进作用。
l4培养基成分是影响纤维素酶生产的关键,主要包括碳源、氮源无机盐和其他微量元素,合适的营养源配比是发酵生产的基础,目前用于纤维素酶生产的培养基大多是在Mandeis营养液的基础上改进而来的。碳源的性质和类型是决定纤维素酶生产成败的关键之一。而采用廉价废弃物作为纤维素酶生产的碳源和氮源,有利于降低生产成本,这方面的研究工作具有明显的实际应用价值,越来越受到人们的青睐。同时在培养基优化方面国内外学者做了大量的工作。曹小红1981等用响应面法对Bacillus。 attoTK一l发酵产脂肤的培养基进行优化,在优化培养基条件下,发酵液的溶血圈直径较初始培养基提高了29.3%,脂肤的产量提高了约30%。董书阁等199]通过响应面分析法对醋酸菌AD发酵培养基进行了优化,优化后醋酸菌产酸量提高了47.18%。孙海彦等I’001经响应面优化研究了培养基成分对尸eniciUiumsP.X一1液态发酵产生淀粉酶的影响。在最优条件下酶活达到 239u/mL,与采用基本培养基的相比,酶活提高了7.5倍。郑毅等【’“’】采用响应面分析方法对产耐高温蛋白酶的苏云金芽抱杆菌(加‘ illusthuri塔 ien.sis)FZ62发酵培养基进行优化,经优化后发酵水平比初始设计提高了3.22倍。sharma,L.等【’“2】利用响应面方面优化发酵培养基后多聚羚基烷酸(PHB)的产量提高了 41.6%,发酵周期缩短了73h。Yuan,Y.J等[’031利用烟碱降解细菌  ℃hrobactrumintermediumDNZ降解烟碱,响应面方法优化培养基后发酵 1oh,95.55%的烟碱被降解。Altaf.M等【’04]利用响应面优化的培养基生产L(+)乳酸,淀粉对乳酸的转化率高达92%,比优化前提高了40%。

4水稻秸秆原料生物转化燃料乙醇

4.1燃料乙醇的优越性和使用现状

新一代交通运输能源必须满足以下基本要求:(1)贮量丰富或容易制取;(2)有利于环境保护,无毒性;(3)存贮与运输方便。生物质燃料乙醇完全符合上述要求。
生物质燃料乙醇的原料极其丰富,特别是中国的7亿吨秸秆更是廉价的原料。乙醇可以直接作为燃料或与汽油以一定的比例混合在机动车中使用,从而降低汽油的消耗,部分地代替石油,减少机动车尾气中COZ的排放量,缓和温室效应;乙醇的辛烷值高于直馏汽油,可以作为防爆剂添加到汽油中,代替四乙基铅,从而可以减轻汽油燃烧废汽中的铅对大气的重金属污染。
巴西、丹麦、芬兰、瑞典等国对生物质乙醇的生产和乙醇作为燃料的应用范围很广。巴西在利用乙醇作为汽油替代品方面走在世界前列,目前己有200万辆汽车用乙醇做燃料。
美国国会早己通过法案,鼓励用乙醇,甲醇等部分或完全代替汽油,扶植非汽油燃料工业的发展。目前美国的许多州己通过法律规定汽车的汽油燃料中必须添加10%一15%的乙醇。15我国对乙醇作为燃料也给予了足够的重视。我国首家生产燃料乙醇的河南天冠集团的产品己率先在河南省的郑州、南阳、洛阳3市的5000多辆机动车中试用后,国家现已全面推广使用车用乙醇汽油。

4.2水稻秸秆纤维素生物转化燃料乙醇的方法

在纤维素原料生物转化为燃料乙醇的过程中,一般原料预处理和终产品分离需单独进行,而水解和发酵可以单独进行也可以同时进行。根据水解与发酵过程的关系,目前主要有三种工艺。
4.2.1分步水解发酵法生产燃料乙醇
将木质纤维素生物质用酶转化为单搪(主要是葡萄搪和木搪),收集酶解后的搪液,然后用微生物(如酵母或者纤维素酶)将糖发酵生成酒精。过程分两步,条件易于控制,是最为常用的方法。此法中常用木霉的纤维素酶来水解纤维素,产生的糖液再进行发酵,其酒精产量可达到97g/l。但这种方法酒精产物的形成受到末端产物的抑制,所以必须不断地将其从发酵罐中移出,采取的方法有减压发酵法、快速发酵法,也可以对细胞进行循环使用,提高细胞浓度,或者筛选在高糖浓度下存活并能利用高糖的微生物突变株,使菌体分阶段逐步适应高基质浓度来克服基质浓度的抑制,另外该法中纤维素需先用氢氧化钠进行预处理,因而成本较高。
4.2.2同步糖化发酵法生产燃料乙醇
用纤维素酶糖化纤维素的最大缺点是糖化速度慢。其原因有以下三个方面:①基质纤维素结构的难分解性;②酶活性低;③纤维素糖化过程中的生成物纤维二糖、最终糖化产物葡萄糖的抑制作用。由于纤维素只有在三种酶的协同作用下刁‘能逐步分解成葡萄糖。但由于β-糖苷酶活性低,而且受最终产物葡萄搪的抑制作用,所以使纤维二糖积累起来,又抑制Cl酶、Cx酶的作用,为促进糖化的进行,必须使用更多的β-葡萄糖苷酶。为了解决生成物中纤维二糖、葡萄糖的抑制作用,同时糖化发酵法引起了人们的重视。
同时搪化发酵法就是在一个生物反应器中同时进行糖化和发酵。在该工艺过程中,纤维素水解后产生的葡萄糖可以被不断的用于发酵,因而消除了高浓度葡萄糖对纤维素酶活性的产物抑制,简化了设备,缩短了生产周期,提高了生产效率l’09,”01。但SSF也存在许多问题有待于进一步研究解决:
(l)工艺条件很难满足两者的优化条件,如糖化和发酵的温度不一致,温度对SSF过程的影响十分复杂。随温度的升高,纤维素酶活力相应升高,可以提高酶对纤维材料的转化速度,然而,在温度升高后,同样会加速酵母的代谢速度,并降低纤维素酶的催化寿命。
,16纤维素酶最适糖化温度一般为50℃,而酒精发酵最适温度为30℃,很难使糖化和发酵同时处于最适温度状态。
(2)酿酒酵母必须经过一个生长、积累过程后才能进入发酵阶段,而这一过程需要消耗葡萄糖和其它营养物质,同时也延长了反应时间。
(3)在SSF工艺中,纤维素酶、酿酒酵母和纤维素原料共处于一个反应器中,由于纤维素原料的比容较大,底物和终产物燃料乙醇的浓度都将受到限制,这种情况下乙醇的分离提取成本将会有所提高。
(4)在SSF过程中添加纤维二糖酶虽然可以提高纤维素对乙醇的转化率,但同时也增加了水解酶的成本。
最近许多研究者将同步糖化发酵技术、反应器祸合技术与分批补料技术相结合,使纤维素酶得到重复利用,发酵液中酒精浓度显著提高l川l。
4.2.3固定化细胞发酵生产燃料乙醇
固定化细胞发酵具有使发酵器内细胞浓度提高,细胞可连续使用,使最终发酵液酒精浓度得以提高等优点。研究最多的是酵母和运动发酵单胞菌的固定化。常用的载体有:海藻酸钙、卡拉胶、多孔玻璃等。最近又有将微生物固定在气液界面上进行发酵的报道,微生物活性比固定在固体介质上高。固定化细胞的新动向是混合固定化细胞发酵,如酵母和纤维二糖酶一起固定化,将纤维二糖基质转换成酒精,此法引人注目,被看作纤维素原料生产酒精的重要阶段l”4,”’]。

4.3酿酒酵母途径工程应用于燃料乙醉的生产

途径工程是利用分子生物学原理,分析细胞代谢网络,通过合理设计的DNA重组,完成细胞特性改造的应用性学科。途径工程在分析代谢途径的基础上,定性地改变细胞内代谢流走向,调整原有代谢网络,进而提高特定代谢物的产量。外源基因的准确导入及其编码蛋白的稳定表达,可以拓展细胞内现有代谢途径的延伸路线,以获得新的生物活性物质或者优良的遗传特征。
Nielsen等论述了途径工程作为一种重要的手段通过不同的途径在基因工程菌构建中的应用。微生物细胞具有很高的适应环境及繁殖能力,其自身的代谢网络是很有规律的,但是自然所形成的代谢网络往往缺少某些特定代谢途径或具备相关代谢途径却获取不到高产量的产物,因此通过基因工程手段对菌株代谢流的改变或对代谢途径的扩展及重新构建是途径工程中最主要也是最关键的问题。许多传统的工业产品是通过传统的发酵工业来获取,由于微生物菌种遗传特性的限制,通过优化发酵条件难以获得或大幅度提高产物l7的产率,随着重组DNA技术的日益完善,人们通过基因重组技术改变微生物代谢途径的某些关键步骤,从而获得或提高某些产物的产率,以生产出传统发酵工业无法获得的新产品。
近几年来途径工程得到迅猛发展,表1一1列出了几个途径工程的应用实例。
表1一1代谢工程的应用实例
Tablel一   1APPlieationofmetabolieengineering
所用菌株实验结果文献
 Clactofermentum苏氨酸产量增加l一2倍Varner,J。ral.1999[,2,l
PPutida苯类等毒物分解Le。。tal.1995I,221
E.。oliL一苯基丙氨酸生产Baez一15veros,.丈乙.。ra[20071,231
 Cacremonium头抱菌素C产量增加25%Skatrud。tal.1989[’24]
目前,途径工程在拓展和构建新的代谢途径方面有较大的发展,尤其在燃料乙醇的生产方面尤为突出。燃料乙醇产业的成功推广,离不开有良好的菌株。菌株必须能有高的乙醇耐受力,有高的乙醇转化率(大于理论值的90%),有较高的生产率(大于1留(L*h))。
酿酒酵母(saccharo梢 lycescerevisiae)是传统的酒精生产菌株,其全序列已测定,遗传操作技术也已经成熟。作为酒精生产菌株,酿酒酵母(S.。erevisia。)具有许多优良特性:“)在厌氧条件下的良好生长能力;“i)发酵葡萄糖有较高的乙醇得率;“ii)对一些生长抑制因子如乙酸、糠醛等具有较高的抗性,而这些生长抑制因子往往存在于木质纤维材料的水解物中;(iv)较高的乙醇耐受性,Brown等I’251报道,在生长状态下酿酒酵母(s.。erevisia。)
对乙醇的耐受力可达12og/L;(v)被公认为 GRAs(GenerallyRegardedAssafe)微生物。
在过去的10~15年里随着DAN重组技术的发展与完善,近年来以开辟新的代谢途径为目的的酿酒酵母代谢工程菌的构建已广泛开展,已在酿酒酵母中克隆并表达许多外源基因。
主要用于酿造工业和燃料酒精生产。
酒精代谢属于初级代谢,大部分反应为多数微生物相同的公共代谢途径,因此拓展酿酒酵母代谢途径只需加入与代谢相关的基因即可实现。shigechi等l”01利用细胞表面工程构建表达α-淀粉酶和糖化酶的酵母,利用生淀粉发酵产生乙醇。该酵母能在72h内产生61.8g/l乙醇,是生玉米淀粉理论收率的86.5%。Ho等将木糖还原酶(催化木糖生成木糖醇),木糖醇脱氢酶(催化木糖醇生成木酮糖)和木酮糖激酶(催化木酮糖生成52磷酸木酮糖)的基因通过载体转入酿酒酵母,首次成功构建可以利用葡萄糖和木糖生产乙醇的工程酵母。随后Ho等又将上述3个基因的多拷贝整合到酵母染色体上,得到了稳定的工程酵母,可以在36h发酵每升含539葡萄糖和569木糖的混合发酵液产生50g/L乙醇。鲍晓明等将木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、转酮酶和转醛酶4个基因在酿酒酵母中表达,重组菌株可以利用木糖发酵生产乙醇。在利用酿酒酵母表达纤维素酶方面,Fujita等l”,】将两种纤维素水解酶在酵母表面表达,成功构建能降解纤维素的酵母。该酵母表达了来自Trichodermareesei的葡聚糖内切酶n和来自 AsPergillusaculeatus的β-葡萄糖苷酶,能在50h内直接发酵β-葡聚糖(45g/l)产生16.5g/l乙醇,碳水化合物转化率为0.48留g,是理论值的93.3
%。张梁等l’34}利用来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因,构建了重组质粒PYx一BGL,并在酿酒酵母w303一IA中获得表达,得到的转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长。周衍以来源于扣囊复膜饱酵母的β-葡萄糖苷酶基因BGLI转化酿酒酵母工业菌株,转化子可以在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长,培养36h,β-葡萄糖苷酶酶活达到 0.967U/mL;以纤维二糖为唯一碳源的酒精发酵中,酒精度可以达到0.92g/L。洪剑辉等l”6]以扣囊复膜饱酵母染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增到其β-葡萄糖苷酶基因BGLI,经EcoRI、BamHI双酶切后和穿梭表达载体pYXZ12连接,构建了重组质粒转化酿酒酵母w3O3一IA,BGLI基因获得了活性表达,β-葡萄糖苷酶活力为 0.504Iu/mL。转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长,并能应用于同时糖化和发酵纤维素底物生产乙醇,使乙醇产量较宿主酵母有了一定的提高。提高酿酒酵母对木质纤维素水解物中酚抑制剂的抗性也是利用途径工程技术改良酿酒酵母的内容之一。将来自升口 metesversicoto:的漆酶基因在尸GKI启动子控制一下在酿酒酵母中表达,结果提高了由可再生原材料生产乙醇的产量。

5本研究的目的、意义和主要内容

5.1本研究的目的和意义

纤维素是地球上最丰富的碳水化合物,也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。如何合理利用这一资源,特别是用于转化燃料乙醇,缓解能源危机,将对人类的可持续发展具有非常重要的意义。纤维素酶活力和纤维素糖化效率不高一直是纤维素类物质生物转化的瓶颈,虽然同时糖化发酵方法(SSF)可有效去除水解产物葡萄糖的反馈抑制,提高纤维素糖化效率,但SSF过程中纤维素的酶水解受到糖化中间产物纤维二糖的强效抑制,以及与酒精发酵温度不一致等问题,严重影响了纤维素的生物转化。本实验研究是水稻秸秆纤维素生物转化生产燃料乙醇的基础研究,通过本实验研究,其目的旨在:
(1)获得高活力纤维素酶,降低燃料乙醇生产成本
纤维素是由β-1,4-葡萄糖昔键连接形成的线形聚合体,不溶于水,传统的化学方法控制纤维素降解难度大,成本高,对环境污染严重,生物降解法有效地克服了这些不足,利用微生物诱导产生的纤维素酶系可降解纤维素生成葡萄糖,再发酵成为燃料乙醇。近年来t9广泛开展了对纤维素酶的研究。但纤维素酶水解成本较高,主要因为纤维素酶生产菌株酶活力较低,生产过程也未能处于最佳生产状态,使得酶法生产燃料乙醇迟迟未能实现工业化,因此,获得高产纤维素酶菌株及其发酵控制非常重要。
(2)分离纯化纤维素酶,进行N端测序和质谱分析,为探讨纤维素酶水解机理以及纤维素酶基因的克隆和表达奠定基础。
(3)获得代谢纤维二糖的酿酒酵母工程菌,消除纤维二糖对水稻秸秆纤维素酶水解的抑制,提高水稻秸秆纤维素酶水解效率。
纤维素酶水解生成葡萄糖至少需要3种酶协同作用。内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶把纤维素降解成纤维二糖,它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。在这个过程中β-葡萄糖苷酶的作用非常重要,β-葡萄糖苷酶活(BG)/滤纸酶活 (FPA)=1.0时酶解效率最高,而在纤维素酶组分中β-葡萄糖苷酶含量少、活力低,成为纤维素酶解的瓶颈。增加纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活性,会有效提高纤维素酶解效率,因此通过基因重组技术构建工程菌,分泌表达高活性β-葡萄糖苷酶对纤维素有效降解具有重要意义。国内外学者对许多不同来源的β-葡萄糖苷酶基因都进行了克隆与表达研究。但这些改造都是希望宿主微生物能够大量积累β-葡萄糖苷酶,以获得商业用β-葡萄糖苷酶,再将β-葡萄糖苷酶直接像糖化酶一样在酒精生产中添加,虽能达到利用纤维二糖的目的,但生产环节增加,增加过程控制的难度,生产成本也会受β-葡萄糖苷酶价格的影响。若能将β-葡萄糖苷酶基因整合入酒精发酵的酵母并高效稳定表达足够量的β-葡萄糖苷酶活,结合纤维素酶一起应用于酒精发酵,有可能进一步提高原料出酒率,同时对纤维素原料的高效利用也是一种新的探讨方式。
(4)采用新型串联式生物反应器,进一步提高酶解效率和燃料乙醇得率同时糖化和发酵方法(SSF)被认为是纤维素酒精转化最有效的途径。SSF过程应用于酶法糖化和酵母转化纤维素产酒精已经得到广泛的研究,该方法在生物质转化过程中不仅使抑制纤维素酶的水解产物的积累降到最低,而且还减少杂菌的污染。但SSF过程存在纤维素糖化最适温度和酒精发酵最适温度不一致、底物和产物浓度限制等不足,严重影响了水稻秸秆纤维素的生物转化效率和速率。新型的串联式生物反应器祸合代谢纤维二糖的重组型酵母固定化细胞,有望解决了SSF过程存在的不足,对水稻秸秆的高效生物转化燃料乙醇具有重要意义。

5.2本研究的思路和技术路线

利用生物技术将水稻秸秆纤维素高效转化为燃料乙醇是本工作的研究主线,鉴于纤维素酶的生产是实现纤维原料生物转化过程的关键,本文首先拟进行纤维素酶高产菌株的选20育,并对该菌液体深层发酵过程中的关键因子进行研究,以期获得高活力纤维素酶。然后采用基因工程技术获得具有纤维二糖代谢能力的酿酒酵母工程菌并对其细胞进行固定化,通过串联式生物反应器把纤维原料的酶水解、固定化酿酒酵母工程菌发酵作用有机地祸联,以期提高协同生化反应效率和水稻秸秆纤维素对燃料乙醇的转化率。
本研究的技术路线如下:
高产纤维素酶菌株的选育构建代谢纤维二搪酿酒酵母工程菌
酉酉酉                          酉酉良酒酵母工程菌菌  
细  细                          细  细胞固定化    化  
菌菌优化发酵培养基基基基基基基基基                基  水                水水水稻秸秆秆秆秆秆秆秆秆秆秆秆秆  
预预预预预预预预预预预预处理  理                      
固固固固固固固固固固固        固  固固定化细胞增殖  殖
览览酵生产纤维素酶酶酶酶酶酶酶酶  酶  培养及装柱    柱
酶酶水解反应罐罐                              
  (((50“                                 C)))
二二级串联式生物反应器  器                
水水稻秸秆高效转化燃料乙醇  醇              
发发酵条件的优化      化
响响应面优化发酵培养基基
分分批发酵生产纤维素酶酶

5.3本研究的主要内容

根据课题确立的研究目标,拟主要进行以下四个方面的研究:
(l)利用水稻秸秆生产高活力纤维素酶的研究。拟进行优良纤维素酶生产菌株的筛选和遗传改造;以水稻秸秆为主要碳源,对其液体发酵培养基和发酵过程因子进行优化,提高纤维素酶活力和产量,形成其高活力纤维素酶生产技术;形成纤维素酶SL发酵罐分批发酵放大技术。
 (2)纤维素酶的分离纯化及相关分析研究。拟形成YT02所产纤维素酶的分离纯化技术;得到电泳纯的纤维素酶;对其进行N端测序和质谱分析,为进一步对其空间结构、酶学特性和协同作用的降解机制研究奠定基础。
(3)代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌构建及其细胞固定化研究。将纤维二糖酶基因引入乙醇生产能力强的酿酒酵母工业菌株并得到活性表达,并将酿酒酵母工程菌细胞进行固定化发酵,有效消除纤维二糖对酶解反应中的强效抑制,提高水稻秸秆纤维素转化水平。
(4)串联式生物反应器协同转化水稻秸秆生产燃料乙醇的研究。拟研究水稻秸秆生物转化过程中特有的化工特征,建立水稻秸秆纤维素液相酶解和代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌固定化细胞同步糖化发酵的祸合新技术,提高纤维素酶生产效率和产物乙醇得率;形成水稻秸秆纤维素高浓度发酵技术。
 

第二章纤维素酶高产菌株的选育及

产酶条件研究

水稻秸秆资源主要成分是纤维素,其生物转化燃料乙醇的主要环节是水稻秸秆纤维素的酶水解,纤维素酶的生产是水稻秸秆生物利用的关键,而缺失高产菌株一直是制约纤维素酶大规模生产的主要因素,因此分离选育高产纤维素酶菌株是水稻秸秆生物转化燃料乙醇的关键因素之一。纤维素是自然界中最丰富的可再生资源,自然界中能降解和利用纤维素的微生物种类繁多,真菌、细菌、放线菌和部分酵母菌等都能产纤维索酶降解纤维素。但降解效率较高的主要还是集中在胞外酶活性高的真菌,如瑞氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Triehoderm。viride)和腐皮镰抱(Fusarior。,olani)等。本研究从云南高黎贡山原始森林自然生境的腐殖中分离筛选得到了纤维素酶高产菌株YT01,上〔纤维素酶活力高于目前纤维素酶工业生产菌株斜卧青霉(Penicilll’ umdecumben、),乓有仁业应用价值,经初步鉴定为青霉。采用原生质体紫外诱变的方法对YT01进行选育,得到了突变菌株YT02,并初步研究了青霉YTO2的产酶条件及其酶液的酶学性质。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与溶液配制
1.1.1.1试剂
梭甲基纤维素钠(sigma);可溶性淀粉(湖州);蜗牛酶 (snailDigestase)购于中国科学院生物物理所生化试剂厂;纤维素酶(Celfulase)购于中国科学院上海生物化学研究所;水稻秸秆取自湖南省长沙市郊稻田,粉碎后过40目筛备用:试验中所用其它试剂均为分析纯。
1.1.1.2高渗溶液
 0.01mol/L磷酸缓冲液 (pH6.8),   20nunoFLMgC12, 0.5mol/L蔗糖。
1.1.1.3醋酸一醋酸钠缓冲液(pH4.8)
甲液:准确称取 27.22gNg/le·3HZo(M厂一36.05)在 200mL烧杯中,蒸馏水溶解并定容至IL配制成 0.2mol/L的NaAc溶液。
乙液:移液枪精确量取 11.8mL冰乙酸(99.0%),定容到 1000mL,配制成 0.2mol/L的NaAc一HAc溶液。
23待用时,量取 410mL乙液与 590mL甲液混合配制成pH=4.8的 0.2mol/L的HAc一aAc缓冲溶液 1000mL。
1.1.1.4DNS试剂
甲液  :NaoH1049溶于  1300mL蒸馏水中。
乙液:3,5一二硝基水杨酸309加入甲液中混匀,加热溶解。
丙液:酒石酸钾钠9109溶于 2500mL蒸馏水中。
丁液:259重蒸酚,加259无水亚硫酸钠,加入丙液中。
将以上各步骤的溶液混合,加入 1200mL蒸馏水(总体积 5000mL),放在棕色瓶中,暗处放置一周后即可使用。
1.1.1.51%CMC-Na溶液
称取  1.0009CMC一Na于 100mL烧杯中,加入20一 40mL、 0.2mol/L、 pH4.8的HAe一NaAe缓冲液,加热溶解,转移到 100mL容量瓶定容,4℃冰箱保存,保存期l一2周。
1.1.1.61%水杨昔溶液
称取l.OoogD一水杨苷(D一saliein)于 100mL烧杯中,加入适量的 0.2mol/L、 pH4.8的HAc一NaAc缓冲液,加热溶解,转移到 100mL容量瓶定容,4℃冰箱保存,保存期l~2周。
1.1.2菌种与菌种分离源
用于菌种分离的腐殖质采自滇西北中缅边境的高黎贡山原始森林自然生境,该地区植被类型多样,土壤肥力高,纤维素降解菌丰富。
纤维素酶工业生产菌株斜卧青霉:夏盛实业集团有限公司杜仲平先生惠赠。
里氏木霉3.3010:公认纤维素酶高产菌株,购自中国科学院微生物研究所。
1.1.3培养基
1.1.3.1初筛培养基I:Hutchinson滤纸固体培养基
将 12cm的Whatman定量滤纸剪成直径为 8.5cm的滤纸片,经1%稀酸浸泡过夜,除去淀粉与其它杂质,以大量蒸馏水漂洗滤纸,121℃灭菌 30min,烘箱内干燥,覆盖于Hutchinson固体培养基上。
Hutchinson固体培养基(g/L):
KHZpo4:10:NaCI:l;MgSO4.7H20:3;NaNo3:25;FeC13:0.1;CaC12:l:琼脂粉:18。
1.1.3.2初筛培养基n:刚果红鉴定培养基(g/l)
24(NH4):504:2;Mgso4·7HZo:0.5;KHZPo4:l;NaCI:0.5;梭甲基纤维素钠:20:刚果红:0.2;琼脂粉:20。
1.1.3.3马铃薯琼脂培养基(PDA培养基,g/l)
去皮马铃薯:200:葡萄糖:20;琼脂粉:20。
1.1.3.4再生培养基(RM,g/l)
琼脂:20;NaNO3:3;KZHpO4:l;MgsO4·7HZO:0.5;KCI:0.5;FeSO4·7H20:0.01;蔗糖:30。以高渗溶液配制。
1.1.3.5液体发酵复筛培养基(g/l)
水稻秸杆粉(40目):20;麸皮浸出液:10;葡萄糖:0.5;蛋白脉:1;(NH4):504: 0.2;KHZPO4:0.3。
1.1.4主要仪器与设备
 EppendorfBio一photometer分光光度计;ZHWY一  21ID型恒温培养振荡器;FOSS纤维素测定仪;CJT一16洁净工作台;PHS-gV型酸度计:Sartorius电子天平;SANYO恒温培养箱 ;EppendorfCentrifugesso4R离心机;Lnzx一4oBI型立式自动电热压力蒸汽火菌器:Eleetrolux冰箱。

1.2方法

1.2.1水稻秸秆的预处理
称取水稻秸秆粉,用酸碱在室温下(25±1℃)预处理4d,固液比为1:10,再用酸碱中和ld,自来水充分冲洗后在80℃烘干备用。
 1.2.2纤维素酶高产菌的分离与纯化
无菌操作称取腐殖质2g于装有 50mL灭菌生理盐水并带有小玻璃株的 250mL三角瓶中,30℃ 200r/min充分振荡 30min。取上清液 1mL,无菌生理盐水梯度稀释。分别吸取0.5mL各稀释度样液于初筛培养基I上,均匀涂布,每个样3个平行。30℃恒温培养4~5d。挑取滤纸上的真菌菌落于PDA培养基上划线分离,得到纯培养。纯化后的单菌落转接初筛培养基n,在刚果红培养基上,根据水解圈的直径与菌落直径的比值的大小确定初筛菌株。将初筛菌株接种液体发酵培养基,30℃ 200r/min振荡培养120h。发酵液经8000r/min离心 10min,取上清液测定纤维素酶活。
1.2.3纤维素酶高产菌的初步鉴定
菌种鉴定参照魏景超《真菌鉴定手册》和《微生物学实验教程》进行。
1.2.4纤维素酶高产菌的原生质体紫外诱变
1.2.4.1  YT01原生质体的的制备
将在PDA培养基上生长了4d的YT01饱子刮到装有 20mL生理盐水的三角瓶中,置于30℃摇床上 150r/min震荡 10min,用4层无菌擦镜纸过滤,滤液 3000r/min,离心 10min,弃去上清液,用生理盐水洗涤1~2次,然后对悬浮液进行镜检和计数,调整孢子浓度为5、10个/mL,均匀点滴20~30滴至覆盖有无菌玻璃纸的PDA培养基上,30℃培养18h,可见薄层菌丝。用无菌镊子将培养好菌丝体的玻璃纸揭下,置于无菌高渗纤维素酶与蜗牛酶的复合酶液中轻摇,使菌丝体分散于酶液中,取出玻璃纸,将平皿置于32℃培养箱中酶解,在酶解过程中应间歇摇动使酶解充分,并定时取样,在相差显微镜下进行原生质体形态的观察和计数,直至大部分原生质体放出,1000一1500r/min离心,弃去酶液。用高渗悬浮液洗涤二次,沉淀原生质体用 10mL高渗溶液悬浮, 500r/min离心 10min,得到纯化的原生质体。
1.2.4.2原生质体再生
取一份原生质体悬液,用高渗溶液适当稀释,调整原生质体浓度至 107mu’,吸取0.1mL于下层固体再生培养基上,再加入0.8%琼脂再生培养基,轻轻摇匀,双层平板法于30℃再生。同时另取一份原生质体用无菌水稀释,先让原生质体破裂,再用同样方法再作对照,培养3d后计算再生菌落数,并计算原生质体再生率。
1.2.4.3紫外诱变
适当调整原生质体浓度至1护mL一’,取 10mL原生质体高渗悬液于无菌平皿中,在30W紫外灯下 25cm处照射20一505,取 0.1mL涂布再生培养基, 30℃双层平板培养3d,计算再生率和致死率,取致死率为98%以上的原生质体于覆盖有玻璃纸的再生培养基上暗室中培养再生,待原生质体再生出细胞壁后用无菌水洗下,适当稀释后涂布PDA平板,30℃双层平板培养3d,打孔器打取琼脂块,移入无菌的平板中,28℃培养一定时间,然后将琼脂块移于初筛培养基n上,30℃下保温24h,观察水解透明圈大小,选透明圈与菌落直径比大的菌株分离至斜面上,以供进一步复筛。
1.2.4.4复筛
将初筛得到的单菌落接入液体发酵复筛培养基中进行培养,测定纤维素酶各组分活性。得到的高产突变株YT02,YT02连续传代以检验其遗传稳定性【’48]。
  1.2.5 YTO2产纤维素酶的液体发酵培养方法
将YT02接种于斜面培养基 (PDA)上,在28士1℃培养4d,  500mL三角瓶装液量 100mL发酵培养基,以121℃灭菌 30min,接种用生理盐水冲洗的孢子 1mL(饱子数约为107/mL),30℃旋转式摇床振荡(200rpm)培养120h,离心上清液即为粗纤维素酶液。
1.2.6不同预处理水稻秸秆的酶水解
粉碎至40目的不同纤维素原料,用水充分洗涤后干燥至恒重,分别取0.69大试管中、利用YT02发酵生产的纤维素酶进行酶解,酶加量为  FPA1SIU/g加入 50mL纤维素,以商品酶I(诺维信公司生产)和商品酶n(夏盛生物工程公司生产)为对照,加入0.1mol/LNaAe一HAe缓冲液(pHS.o)至 30mL。 50Oe酶解 24hl’49]。离心,充分洗涤沉淀,干燥称重,计算酶解率,酶解率二原料失重/0.6,每个试样三个平行。
1.2.7分析方法
1.2.7.1不同预处理水稻秸秆纤维素、半纤维素和木质素的测定
纤维素、半纤维素和木质素的测定参考王玉万的方法l”0]。
1.2.7.2纤维素酶活性的测定(DNS法)
纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖,还原糖能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原为氨基,溶液变成橙色的氨基化合物3-氨基-5-二硝基水杨酸,在一定的还原糖浓度范围内,还原糖浓度与橙色的深度成正比关系。据此可以推算出水解液中还原糖的含量及纤维素酶的活力。
(l)葡萄糖标准曲线的绘制
准确称取 100.0mg分析纯的无水葡萄糖(预先在105℃干燥3一4h至衡重),用少量蒸馏水溶解后,定量转移到 100mL容量瓶中,再定容到刻度,摇匀,浓度为lmg/mL。
取s根试管,从O一7编号,分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2与  1.5mLlm创mL的葡萄糖溶液,共8个处理。每管加入DNS试剂2mL,置于沸水中,水浴10min,再冰浴冷却,以蒸馏水定容到 10mL,混匀,于540nm测定OD值。以OD540一葡萄糖含量作图,得到葡萄糖的标准曲线,线性回归得到扩=0.9962>0.9950,线性效果较好(见图2-l)。
图2一1葡萄糖标准曲线
(2)滤纸酶活(FPA)的测定
滤纸酶活代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶所组成的复合酶系的协同水解纤维素的能力,是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。滤纸酶活单位定义为:以滤纸为底物,在一定条件下(pH4.8;50℃恒温lh),以 1mL纤维素酶液 1min催化水解纤维素生成1μmol的葡萄糖为1个滤纸酶活单位,以IU表示。
将lx6em(so.000mg)(定量滤纸直径12.5em)折叠放入试管底部,加入lmLpH4.8的HAc一NaAc缓冲液和 0.5mL适当稀释倍数(粗酶液)的发酵酶液,混匀。置于50℃水浴 60min,冰中冷却,加入  2mLDNS试剂煮沸 10min,冰中冷却,加蒸馏水定容到 10mL,混匀,54Onm测OD值。对照处理:将 0.5mL稀释酶液先于沸水中 10min中灭活,加入 1mLpH4.8的HAe一NaAe缓冲液和滤纸条,再加入2mLnNS试剂煮沸lomin,冰中冷却,加蒸馏水定容到10mL,混匀,540nm测OD值,每个处理3个平行。根据标准曲线方程计算酶活性。
(3) 梭甲基纤维素酶酶活测定(CMC酶活/内切葡聚酶活)
CMC酶活代表内切葡聚糖酶活。其单位定义为:以l%梭甲基纤维素钠为底物,在一定条件下 (pH4.8;50℃恒温15min),以 1mL纤维素酶液 1min催化水解梭甲基纤维素钠生成1μmol的葡萄糖为1个滤纸酶活单位,以IU表示。
取 0.5mL适当稀释倍数的粗酶液,加入 1mLI%CMC一Na溶液,混匀,置于50℃水浴15min,冰中冷却,加入  2mL DNS煮沸 10min,冰中冷却,加蒸馏水定容到 10mL,混匀,540nm测OD值。对照处理 :0.5mL培养液加入 1mL 1%CMC-Na溶液,再加入  2mL DNS煮沸 10min,冰中冷却,加蒸馏水定容到10mL,混匀,540nm测OD值,每个处理3个平行。根据标准曲线方程计算酶活性。
(4)β-葡萄糖苷酶酶活测定(纤维二糖酶)
取 0.5mL稀释适当倍数的发酵液,加入 1mLI%水杨苷溶液,混匀,置于50℃水浴 30min,冰中冷却,加入  2mLDNS煮沸 10min,冰中冷却,加蒸馏水定容到 10mL,混匀,540tun测OD值。对照处理 :0.5mL稀释酶液加入 1mLI%水杨昔溶液,再加入 2mLDNS煮沸 10min,冰中冷却,加蒸馏水定容到 10mL,混匀,于540nm测OD值。以 1mL纤维素酶液 1min催化水解水杨昔产生1娜ol的葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位,每个处理3个平行。根据标准曲线方程计算酶活性。
1.2.7.3 发酵液pH测定:pH计法。
 

2结果与分析

2.1不同预处理水稻秸秆的各组分含量

水稻秸秆粉(过40目)后经过1.0%的盐酸处理、1.0%氢氧化钠处理及1.0%的盐酸和 1.0%氢氧化钠复合处理 (l.0%的盐酸处理Zd,大量水冲洗后,再以 1.0%氢氧化钠处理Zd后,可以降低半纤维素和木质素的含量,提高纤维素的相对含量,结果见表2-1。
表2一1水稻秸秆经不同预处理后各组分含量的变化
TableZ一  1Contentsofcellulose,     hemicelluloseandlignininricestlaw勿difl贻 rentPretreatinents
预处理方式纤维素半纤维素木质素其它
未处理36.肚 2.33927.肚 1.63211.5士 1.97224.5士2.939
l%HCI处理44.肚3.657*21.狂2.785*
l%Na0H处理49.肚4.323*24.牡2.096
9.8士 1.006
 5.3士 1.201#
23.矢2.068
  21.1士2.308
 l%HCI+l%NaOH58.狂3.997#16.肚2.389#4.1均.972#20.6士2.217
注:*,与未经处理的稻草粉相比,P>0.05;’,与未经处理的稻草粉相比,代0.01。
Note:*,  vsthesti妞 wpo初 erwi山 outpre.treatlnentp>0.05:#,vs小es姗即  wderwithoutpre一treatment,
p<0.01.
从表2一1可以看出,经过 1.0%NaoH+l.0%HCI预处理的稻草粉纤维素含量可以达到58.7%,显著高于未经处理的稻草粉。这与Galbe等的实验结果一致【’。

2.2纤维素酶高产菌的分离与筛选

采集的腐殖样品经加水振荡后,涂布在初筛培养基平板上,30℃恒温培养sd,产纤维素酶的真菌能在以滤纸为唯一碳源的Hutohinson固体培养基上生长形成较大菌落。图2-2是部分菌株在滤纸上形成的菌落,其中图2-2(B)为YT01。
图2-2滤纸上产纤维素酶的真菌菌落
Fig.2一       2FungusProdueingeellulaseonthefilterPaper
挑取滤纸上的真菌菌落于PDA培养基划线分离,得到各菌纯培养株。纯化后的单菌落转接初筛培养基n,在纤维素刚果红培养基上,菌落周围能够形成透明的水解圈,透明圈是由于微晶纤维素高分子量的葡聚糖分子能与刚果红染料紧密结合,当菌株产生纤维素酶时,周围的葡聚糖被降解而形成,应用此原理可进行纤维素酶产生菌株的快速鉴别和酶活力大小的初步估计。图2-3为YT01和纤维素酶工业生产菌株斜卧青霉在CMC刚果红平板上形成的透明圈。
图2一 3YT01和斜卧青霉在刚果红平板上形成的透明圈
Fig.2一  3TransParentzonesformed妙 YT01andPenicilll’   umdecumbeoinGang一  guoRedmedium
从图2一3可以看出,YT01和斜卧青霉菌落周围透明圈直径与菌落直径比值相当,但YT01的水解透明圈比斜卧青霉更清晰,对周围的葡聚糖降解能力可能更强。
从10份腐殖样品中分离获得了68株纤维素酶产生菌,选取菌落周围透明圈直径与菌落直径比值较大且清晰的菌落进行液体发酵复筛,共挑取30个菌株进行发酵,pH自然,30℃, 500mL三角瓶装液量loomL液体发酵培养基,200rpm培养12oh,以纤维素酶工业生产菌株斜卧青霉为对照菌,测定不同菌株发酵液的酶活性。选取产酶水平最高的菌株,命名为YT01。YT01与斜卧青霉、里氏木霉的产酶水平见表2-2。
表2一 2YT01与其它纤维素酶高产菌株产酶能力的比较
几bleZ一 2CaP曲    ilityofeelluloseProductionofYT01andothersti妞insPIDducedhigheellulaseactivity
菌种FpA(IU/mL)CMC酶活 (IIJ/mL)卜葡萄糖苷酶活(IU/切山)
 YT012.2肚0.211*148.6矢8.771*0.83土0.137.
里氏木霉2.23均 .203173.3肚 7.4520.9矢0.125
斜卧青霉1.73均 .125120.3升 9.7860.5肚0.096
注:*,与斜卧青霉相比,酶活有显著性差异,P>0.05。
Note:*,  vsPenicilliumdecumbe彻,p<0.05.
由表2一2可知,YT01纤维素酶各组分活性均高于纤维素酶工业生产菌株斜卧青霉,与公认高产纤维素酶的里氏木霉滤纸酶活力相当,无显著差异。

2.3纤维素高产菌YT01的菌种鉴定

YT01在PDA培养基上培养3d后,菌落黄色略带红色,菌落表面干燥,液体静置培养在液体表面形成淡黄色菌膜,液体摇瓶培养在三角瓶上形成淡黄色菌膜圈。显微镜下观察(经棉酚蓝染色),分生孢子梗从菌丝中垂直生出,无足细胞,顶端生排列成帚状的间枝,分枝一次或多次,对称或不对称,顶层为小梗,以切离法生成分生孢子,分生孢子串呈不分枝的链状,单个孢子球形,光滑。初步鉴定菌株YT01为青霉仔乞月icillium)(见图2-4)。
图2一YT01的显微观察(40xl0)
Fig.2礴诵  crograPhofYT01(40x10)

2.4纤维素酶高产菌YT01的原生质体紫外诱变

采用紫外线原生质体诱变方法对YT01进行诱变,以提高纤维素酶发酵产酶水平。YT01原生质体的释放见图2一5,紫外线的致死率选择98%,经反复诱变获得突变株YT02。YT02液体发酵12oh,FPA、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活均值分别为 3.92Iu/mL、 228.47Iu/mL和 1.36IU/mL,相对于出发菌株YT01酶活力分别提高了约73%、54%和64%(见表2 3)。
图2一 5YT01原生质体的释放
Fig.2一   5ReleaseoftheProtoPlastofPenicilll’ umYT01表2一 3YT01原生质体紫外诱变前后产酶能力的比较
TableZ一       3CaPabilityofeelluloseProduetionofYT01byProtoPlastUV-mutagenagsis
菌种FPA(IU/mL)CMC酶活(IU/mL)β-葡萄糖苷酶活(xU/mL)
 YTOI2.14士 0.201142.96士 3.7090.7妊0.107
 YTO23.92士0.122*228.47士7.876*1.36均.036*
注:*,与原生质体紫外诱变前相比(YT01),酶活有显著性差异,P>0.05。
Note:*,    vseaPabilitybeforeProtoPlastUV-mutagenesis(YT01),p>0.05.
菌株YT02在PDA培养基上连续传代十次,每代进行发酵测定酶活性。发酵液滤纸酶
活性达到4.肚0.15,相对误差小于5%,表现出良好的传代稳定性。

2.5液体发酵培养基成分与发酵条件对YT02产纤维素酶的影响

2.5.1不同碳源对YT02产酶的影响
分别以2.0%葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、不同预处理的水稻秸秆粉、玉米秸秆粉、玉米芯粉、玉米皮、白杨木粉、麸皮以及水稻秸秆粉与麸皮(2:l)(纤维素类物质粉碎后均过40目)。作为发酵培养基中的碳源,以1.0%的硫酸铵为氮源,研究不同碳源对YT02产纤维素酶的影响(见表2-4)。
表2-4不同碳源对YT02产纤维素酶的影响
Tab!eZ一      4EffeetofearbonsoureeoneellulaseProduetion
碳源FPA(IU/mL)CMC酶活(IU/mL)β-葡萄糖首酶活(IU/mL)
葡萄糖1.68士 0.12262.12士 5.9980.68士0.042
蔗糖0.82士 0.01378.74土 4.3560.8肚0.093
可溶性淀粉1.59士0, 66775.64士 9.7730.76士0.034
水稻秸秆粉3.19士 0.876164.03士 12.3321.0妊0.109
玉米秸秆粉3.07切 .799178.67士 19.8630.93士0.102
玉米芯粉2.68士  0.231147.8肚 10.1320.87土0.098
玉米皮2.43士 0.43285.47士 10.9970.47土0.027
自杨木粉2.55士0‘ 47794.8肚 9.5690.74士0.067
麸皮1.62士 0.241146.6妊 17.6640.77切.065
水稻秸秆粉+效皮3.23士 0.139173.62士 19.8931.15切.096
表2一4结果的统计学分析表明:就FPA而言,葡萄糖、可溶性淀粉、麸皮组间无显著性差异,水稻秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆+麸皮组间无显著J性差异,玉米芯、玉米皮、白杨木组间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义(p<0.05),以蔗搪组最低,水稻秸秆+麸皮组最高。就CMC酶活而言,蔗糖、可溶性淀粉之间无显著性差异,玉米秸秆、水稻秸秆+麸皮之间无显著性差异,玉米芯、麸皮之间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义(p<0.05),以葡萄糖最低,玉米秸秆最高。就β-葡萄糖苷酶活而言,可溶性淀粉、白杨木、麸皮之间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义(P>0.05),以玉米皮最低,水稻秸秆+麸皮最高。
以上结果分析可以说明,以纤维素类物质为碳源普遍较单糖、双糖及可溶性淀粉有利于YT02产纤维素酶。水稻秸秆粉为YTO2产酶最好的碳源,发酵 120h,发酵液FPA、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活均值分别为 3.19IU/mL、164.03IU/mL和 1.09Iu/mL。其次为玉米秸秆粉、玉米芯粉和白杨木。这可能由于水稻秸秆粉、玉米秸秆粉纤维素含量较高,在高温灭菌后木质纤维素部分水解游离出的纤维素微颗粒对纤维素酶的产生有一定的诱导作用。
水稻秸秆粉、玉米秸秆粉的另一贡献可能是利于菌体生物量的积累,因为纤维素较单糖和双糖难以被微生物利用,发酵液中的还原糖含量较低,不会产生葡萄糖效应。以葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉麸皮为碳源时YT02菌体生长较快,发酵36h在三角瓶上就有白色菌膜圈(其它碳源发酵48h才‘有白色菌膜圈)。但是发酵液粘性很低,生物量含量低,也能检测到一定的纤维素酶活,但远低于以纤维素类物质为碳源的水平,不到水稻秸秆粉的50%。
这可能是由于菌体在利用葡萄糖等微生物易于利用的碳源时产生了较多的代谢副产物,不利于菌体生物量的积累,同时纤维素酶的产生可能受分解代谢阻遏所调节,发酵液中容易利用的碳源(葡萄糖和蔗糖)含量过高,对酶的合成有抑制作用,不利于纤维素酶的生产。
以麸皮为碳源时YT02菌体生长最快,发酵28h在三角瓶上就有白色菌膜圈,说明麸皮对YT02的生长和产酶有明显促进作用,这可能由于麸皮中含有大量促进微生物生长的微量元素和生长因子。
从不同碳源对纤维素酶产酶的影响可以看出,纤维素酶高产的关键是获得较多的生物量,产酶诱导物存在和解除末端代谢产物抑制。添加麸皮可有效促进菌体生长,缩短发酵周期,提高纤维素酶活性。因此,选用水稻秸秆粉和麸皮为YT02纤维素酶生产的复合碳源。
2.5.2不同预处理水稻秸秆对YT02产酶的影响
准确称取29水稻秸秆,分别经过1.0%的盐酸处理、1.0%氢氧化钠处理及1.0%的盐酸和1.0%氢氧化钠复合处理 (l.0%的盐酸处理Zd,大量水冲洗后,再以1.0%氢氧化钠处理2d)后。作为发酵培养基中的碳源,以1.0%的硫酸铵为氮源,研究不同预处理后的水稻33秸秆对YT02产纤维素酶的影响(表2-5)。
表2一5水稻秸秆经不同预处理后对YT02产纤维素酶的影响
TableZ一          5EffeetofrieestrawbydifferentPretreatmentsoneellulaseProduetionofYT02
预处理方式FPA(IU/mL)CMC酶活(IU/mL)β-葡萄糖曹酶活(IU/mL)
未处理 3.12士0.676161.29士10.323 1.07土0.018
1.0%HCI处理 3.07士0.227166.32士12.116 1.12士0.005
1.0%NaOH处理 3.22士 0.17815 9.87土  ]1.9971.06士0.011
1%HCI+l%NaOH 3.46士0.105167.26士15.436 1.13士0.099
注:各组间无显著性差异。
       Note:There15nosignifieantdiffereneebetweenthegrouPs.
由表2-5可知,水稻秸秆不同预处理对YT02产纤维素酶无明显影响。
2.5.3不同氮源对YT02产纤维素酶的影响
以2%的水稻秸秆粉为碳源,添加1%的麸皮,分别以1%的蛋白胨、卿H4)250;、尿素、豆饼粉、N场NO3、NH4CI和NaNO3为氮源,研究不同氮源对YT02产纤维素酶的影响。
表2-6不同氮源对YT02产纤维素酶的影响
TableZ一       6EffeetofnitrogensoureeoneellulaseProduetion
氮源FPA(IU/mL)cMC酶活(IU/mL)β-葡萄糖苷酶活(IU/mL)
蛋白胨
豆饼粉
 3.63士0.233  218.12士22.985 1.28士0.097
 3.32士0.109178.74士18.763 1.1肚0.198
尿素 2.8牡0.345127.62士15.9930.76士0.024
倒H4)2504
NH4N03
 3.2牡0.213204.03士   21.099*1.02士0.085
 3.07士 0.177138.67士13.8720.83士0.034
 NH4CI2.68士 0.18797.82士 13.0980.87士0.078
 NaNO32.43士 0.16285.47土 10.7650.47士0.013
豆饼粉 +(NH4)25043.5肚 0.119225.36土27.864*1.25均.079
注:*,与豆饼粉相比,酶活有显著性差异,P>0.05。
Note:*,   vssoybeaneakePowder,P>0.05.
从表2一6可以看出:蛋白膝是YT02生产纤维素酶最好的氮源,其次豆饼粉和(NH;)2504。
以蛋白脉、豆饼粉和(N场):504为氮源时,菌体生长较快,发酵结束时发酵液pH值在5.0左右,菌体生物量高,以手摇动三角瓶有坠手感。纤维素酶活性高;以NaNO3、NH剥O334和NH4CI为氮源时,发酵液pH值持续升高至7.8左右,YT02生长较慢,纤维素酶活性较低。
以尿素为氮源时,虽然菌体生物量较大,但发酵液中的纤维素酶活性仍较低。从不同氮源对YT02发酵产纤维素酶的影响结果可以看出,有机氮略优于无机氮,钱态氮略优于硝态氮。
蛋白脉为氮源虽然最利于纤维素酶的生产,但生产成本过高。由于大多数微生物倾向利用有机和无机复合氮源,因此YT02纤维素酶的生产以1%豆饼粉和0.2%(NH;):504组成的复合氮源进行实验,效果优于其它任何单一的无机或有机氮源,接近于蛋白胨为氮源时的水平,因此,选用豆饼粉和(NH4):504组成的复合氮源作为YT02纤维素酶生产的氮源。
2.5.4微晶纤维素添加量对YT02产纤维素酶的影响
以2%的水稻秸秆粉为碳源,添加l%的麸皮,以1%的(NH4):50;和豆饼粉为复合氮源,研究不同微晶纤维素添加量对YT02产纤维素酶的影响,结果见表2-7。
表2-7不同微品纤维素添加量对YT02产纤维素酶的影响
TableZ一   7Effeetofmiero一    erystallineeelluloseoneellulaseProduetion
微品纤维素添加量(g/L)FPA(IU/mL)CMC酶活(IU/mL)β-葡萄糖苷酶活(Iu/mL)
 03.57士0.199211.21土 20.5981.82士0.013
 23.16士0.111207.33土 21.2211.68土0.001
 43.23士0.106209.86士 19.3321.79士0.032
 63.37士0.134215.12士 20.6641.77士0.043
 83.69士0.125213.39士 18.7451.93士0.055
 103.52士 0.186217.22土 19.3691.81士0.071
注:各组间无显著性差异。
       Note:There15nosignifieantdiffereneebetweenthegrouPs.
由表2-7可知,不同微晶纤维素添加量对YT02产纤维素酶无明显影响。
2.5.5不同无机盐对YT01产纤维素酶的影响
以2%的水稻秸秆粉为碳源,添加1%的麸皮,选用豆饼粉和(N氏):504组成的复合氮源,分别以0.05%KCI、NaCI、CaC12、MnC12、CuC12、MgSO4、 FeSO4、Znso4作为无机盐进行实验[”51,实验结果见表2-8。
由表2-8可知:添加MgS04对YT02生长有促进作用,生物量明显增加,纤维素酶活力明显提高。其它无机盐对YT02发酵无影响或影响甚微。表2一8不同无机盐对YT02产酶的影响
TableZ一      8EffectofvarioussaltsoneellulaseProduetion
无机盐(0.05%)FPA(IU/mL)CMC酶活(IU/mL)β-葡萄糖苷酶活(IU/mL)
不加无机盐3.6妊 0.307207.05士 20.9611.21士0.057
 KCI3.71士 0.325212.03士21.9761,22土0.086
 NaCI3.73士 0.467208.11士 22.0951.21士0.076
 CaCIZ3.77士 0.412217.62士 19.7691.17士0.097
 MnClz3.72土 0.371205.47士26.7451,05士0.073
 CuC123.75士 0.398214.8肚 15.873134士0.037
 MgSO44.16士0.598*239.32士17.993*1.58士0.021*
 FeSO43.72士 0.389209.6妊  20.7581.27土0.065
ZnS仇3.7牡 0.428206.03士 22.9531.38土0.048
注:*,与不加无机盐组相比,酶活有显著性差异,P>0.05。
Note:*,     vstheeontrolgrouPwithoutino嗯 anicsalts,P>0.05.
2.5.6起始pH对YT01产纤维素酶的影响
以2%的水稻秸秆粉为碳源,添加1%的麸皮,选用豆饼粉和(NH4):504组成的复合氮源,添加0.05%MgsO4。用 0.1mol/LHCI或NaoH将培养基起始pH调到不同的值,进行发酵实验,结果见表2-9。
表2-9起始pH对YT02产纤维素酶的影响
TableZ一    9EffeetofinitialPHofmediaoneellulaseProduetion
pH值FPA(IU/mL)CMc酶活(IU/mL)β-葡萄糖苷酶活(IU/mL)
未调PH值3.56切 .185206.47土21.657一3肚0.012
  3.03.33士 0.127211.12土 20.8651.18士0.099
  4.03.62士 0.258208.74土 32.6571.30土0.027
  5.03.79士 0.186217.64士 24.6521.26士0.075
  6.04.19士0.148*244.03士27.087*1.62士0.055*
  7.03.67士 0.276205.67士 25.7651.23士0.062
  8.03.58士 0.198217.82土 21.6581.17士0.029
 9.03.03士 0.205185.47士 19.0781.1肚0.019
注:*,
Note:*
与未调pH值组相比,酶活有显著性差异,P>0.05。
四     theeontrolgrouPwithoutPHedjustlne呱 P>0.05.
36实验结果表明:起始pH对产酶有很大的影响,当起始pH低于4.0时,不利于YT02纤维素酶的生产,随着pH升高,纤维素酶各组分活力均呈上升趋势,当起始pH为6.0时,酶活力最高;起始pH高于6.0后,随着pH升高,发酵产酶能力降低。可见pH为6.0时最适合YT02发酵生产纤维素酶。
2.5.7装液量对YT02产纤维素酶的影响
分别在 500mL三角瓶中装入 50mL、 100mL、 150mL、ZO0mL、250mL和300mL培养基,进行产酶实验。
表2-10结果表明:就FPA和CMC酶活而言, 50mL和  150mL组间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义(p<0.05),以 300mL最低, 100mL最高。就β-葡萄糖苷酶活而一言, 50mL、 100mL、 150mL组间无显著性差异, 200mL、 300mL组间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义(尸 <0.05),以 250mL最低, 100mL最高。
表2-10装液量对YTO2产纤维素酶的影响
TableZ一      10EffeetofvolumeoneellulaseProduetion
装液量(mL)FPA(IU/mL)cMC酶活(IU/mL)β-葡萄糖奋酶活(IU/mL)
 503.33士 0.192186.22士 23.9971.18士0.087
 1003.82士 0.239224.74士 25.7311.32士0.028
 1503.19士 0.186197.26士 22.7061.26士0.053
 2002.79士 0.175124.04士 20.1820.72士0.041
 2502.07士 0.12297.10士 12.3320.53士0.021
  3001.68士 0.09769.73士 10.9620.71士0.027
以上的结果分析可以说明,装液量对纤维素酶的生产有较大的影响。当装液量为100mL培养基时能获得较佳的产酶效果,酶活力最高。随着装液量的增加,酶活性急剧降低。
此结果反映出溶氧对YT02发酵生产纤维素酶有显著的影响。随着装液量的增加,产酶水平下降,这可能是由于供氧不足,不利于YT02的生长。
2.5.8转速对YT02产纤维素酶的影响
在不同的转速条件下,进行YT02的发酵实验,考察转速对其产纤维素酶的影响。实验结果见表2-11。
表2-11结果的统计学分析表明:就FPA而言,  125r/min、  150r/min组间无显著性差异,ZO0r/min、 225r/min、 250r/min组间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义(P>0.05),以 100r/min最低,以25Or/mln最高。就CMC酶活而言, 200r/min、 225r/min、37250r/min组间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义ρ(p<0.05),以125r/min最低,以 200r/min最高。就β-葡萄糖苷酶活而言, 200r/min、 225r/min、 250r/min组间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义(p<0.05),以 100r/min最低,以250对min最高。
表2-11转速对YT02产纤维素酶的影响
TableZ一       11EffeetofRPMoneellulaseProduetion
转速(r/min)FPA(Iu/mL)eMC酶活(Iu/mL)β-葡萄糖仃酶活(一U/mL)
 1002.79士 0.199144.03士 31.2920.75士0.017
 1253.03士 0.172128.11士 18.3341.19士0.024
 1503.29土 0.146177.62士 21.2231.07士0.038
 1753.52士 0.182195.47士 25.2461.27士 0.023
 2003.85士 0.122224.8肚 28.9971.44士0.017
 2253.9肚 0.193221.58士28.1081,48士0.028
 2503.97士 0.116219.32月 1.2431.51士0.019
以上的结果分析可以说明,随着摇床转速的增加,YT02产的纤维素酶各组分酶活力逐渐增加,但当转速超过 200r/min后,产酶水平增加很慢甚至无增加,从经济利益考虑,在本研究中选择使用 200r/min的转速比较适合。摇床转速主要影响发酵液的溶解氧浓度,YTO2属真菌,是好氧微生物,在生长和产酶过程中要消耗大量的氧,所以在产酶过程中应不断振荡来增加发酵液的溶氧浓度。另外,振荡还可以增加菌丝与发酵液中营养物质的充分接触,使木霉菌种能够获得充足的营养。由以上结果可以看出:转速太低可能导致培养基中溶氧不足,影响菌体生长:太高可能机械剪切力过大,造成菌丝断裂,进而影响产酶。
2.5.9培养温度对YT02产纤维素酶的影响
培养温度对YT02产纤维素酶也有很大的影响,本研究选择了不同温度进行发酵实验,实验结果见表2-12。
表2-12结果的统计学分析表明:就FPA和β-葡萄糖苷酶活而言,23℃、26℃组间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义(p<0.05),以38℃最低,以29℃最高。
就CMC酶活而言,23℃、26℃组间无显著性差异,35℃、38℃组间无显著性差异,其余各组两两比较差异均有显著性意义(P>0.05),以38℃最低,以29℃最高。表2一12培养温度对YT02产纤维素酶的影响TableZ一     12EffectoftemPeratureoneellulaseProduetion
温度(℃)F队(Iu/mL)内切酶活(Iu/mL)β-葡萄糖苷酶活(Iu/mL)
 233.36士 0.118147.23士 22.3171.21士0.077
 263.47士 0.142154.12士 24.1521.13土0.098
 293.74土 0.168237.97土 28.0241.57士0.075
 323.02士 0.132198.34士 20.0961.29士0.024
 352.01士  0.137117.62士 21.1740.68士0.018
 381.29士 0.172106.33士 22.8790.21士0.008
以上的结果分析可以说明,温度对YT02发酵影响非常显著。以培养12Oh为基准,产酶水平以29℃为最高,较高和较低温度对YT02产酶都不利,这可能是因为较低温度影响菌丝体的生长,菌丝体不能达到旺盛生长阶段,所以产酶活力较低,短时间较高温度以刺激菌丝体生长,但长时间温度较高,就可能引起微生物代谢加快,生命周期缩短而影响产酶,所以对于YTO2来说,以29℃为最佳。
2.5.10接种量对YT02产纤维素酶的影响
接种采用孢子悬液,孢子为麸皮琼脂茄子瓶斜面,培养7d后,用无菌生理盐水充分冲洗,以四层无菌擦镜纸过滤,调整孢子浓度至1了个/mL,用不同体积的饱子悬浮液接种(见表2-13)。
表2-13接种量对YT02产酶的影响
TableZ一  13Effeetofin℃ulationvolumeoneellulaseProduetion
接种量(mL)F队(一u/mL)内切酶活(Iu/mL)β-葡萄糖廿酶活(一U/mL)
  1.03.03士 0.129144.17土 29.9920.71土0.018
  2.03.34士 0.117165.81士 25.4390.59士0.002*
  3.03.86士0.175*207.23士22.176*1.40士0.013*
  4.03.82士0.121*195.25月0.962*1.55士0.032*
  5.03.71士0.177*198.18士20.339*1.23士0.064*
  6.03.8妊0.198*206.34士21.073*1.3牡0.066*
注:*,与接种l为 1.OnL相比,酶活有显著性差异,P>0.05。
Note:*,        vsthegrouPwithinoeulationvolumeof1.0mL,P>0.05.
由表2-13可知:随着接种量的增加,YT02产酶水平明显提高,而当接种量为 3mL以上39时,接种量对产酶的影响不大,因此本研究选择接种 3mL孢子悬浮液 (100mL发酵培养基)。
2.5.11培养时间对YT02产酶的影响
根据上述实验结果,选择如下发酵培养基:水稻秸秆粉2%,豆饼粉1%,麸皮2%,装液量 100mL,起始 pH6.0。转速 200r/min,培养温度29℃,每隔sh取样一次,测定pH值及纤维素酶各组分酶活,pH变化结果见图2一6、发酵产酶过程曲线见图2-7。

      0000000000000000月‘︵bl味d月LtO口Q自nI“
划Hd
     081624324048566472808896104
时I’AJ(h)
图2-6摇瓶发酵过程中pH值的变化
 F19.2一      6ChangeofPHvalueinflaskeultivation
石一常亨一币犷一石
****梦
︵曰日\思切习山︵曰曰\匕习Vd匕
·摧*/.’**
**
4
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3
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2
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1
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 nUCU︵日︸0︵日︸八U二 JnU匀工n曰︶二」9自Q白刁.几J.上
︵曰曰\lfl︶as门Q芝Q
  01632  486480
时间(h)
    96112128144
一一CMCase一心一FPΑ-△一CB
图2-7摇瓶发酵过程中CMC酶活、FPA和β-葡萄糖苷酶活曲线
Fig.2一   7ChangeofCMCaseactivity, FPAand卜    glueosidaseactivityinflaskeultivation
注:*,与摇瓶发酵开始产酶的时间相比(30h),酶活有显著性差异,P>0.05。
Note:*,         vsthestartingtimewithenzymeactivityinshakingfermentation(30h), p>0.05.从图2-6可以看出,YT02在摇瓶发酵过程中,pH经过12h延滞期后迅速下降,在40h时达到最低值3.%,接着上升,在64h达到最大值5.39。之后略有起伏,但pH值一直维持在5.0以上,发酵终点的pH值为5.34。
从图2一7可以看出,经过短暂的延滞期,YT02进入对数生长期,30h后开始产酶,纤维素酶活性从48h后增加显著。纤维素酶活性在发酵12Oh达最高,随后略有降低。120h~144h产酶无显著差异。因此发酵周期以120h为宜。

2.6纤维素酶的酶学性质研究

2.6.1温度对纤维素酶各组分酶活的影响
在30~90℃范围内,每隔10℃测定纤维素酶各组分在不同温度下的酶活,结果见图2-8。
︵省\匕口Vd匕
一al﹄ d011﹄J
乙几dqO口Q乙9自,11上︵日n曰   nCUCUnU︸11甘n曰︸︵日U八Ul卜J︵11︺二d︸Ul﹄dgdQ‘O自,几11
︵省\日︶。s‘舅口
 4060
温度(℃)
 80100
-口,CMCase一.一FPA
图2-8温度对CMC酶活和FPA的影响
 F19.2一  8EffeetoftemPeratureonCMCaseactivityandfilterPaPeractivity
图2-8结果的统计学分析表明各不同温度下的CMC酶活和滤纸酶活均有显著性差异 (P>0.05)。可以看出,CMC酶和滤纸酶的最适温度都为50℃。将纤维素酶的粗酶液50℃保温24h,按照标准方法测定CMC酶活和F队,结果显示:CMC酶活下降了15%,FPA下降了13%,YT02纤维素酶表现出较好的热稳定性。
 2.6.2pH对纤维素酶各组分酶活的影响
配制不同pH(pH2.0一8.0)的 0.05mol/LHAc一NaAc缓冲液,然后用上述缓冲液分别配制1.0%的CMC一Na,按照标准方法分别测定CMC酶活和FPA,来研究纤维素酶各组分的最适pH。实验结果见图2-9。
 3.5
︵曰曰\思口Vd匕njg自汀
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10
PH
一-一CMCasese心一FPA
图2- 9  pH对CMC酶活,FpA的影响
 F19.2一          9EffeetofPHonCMCaseactivityandfilterPaPeractivity
图2-9结果的统计学分析表明各不同pH值下的CMc酶活和滤纸酶活均有显著性差异(p<0.05)。可以看出,CMC酶的最适pH为4.8,而滤纸酶的最适pH为5.0。

2.7纤维素酶对不同预处理水稻秸秆的酶解试验

利用YTO2纤维素酶、诺维信纤维素商品酶和夏盛纤维素商品酶,分别对不同预处理的水稻秸秆进行酶解,计算酶解率,结果见表2-14。
表2-14不同预处理水稻秸秆在不同纤维素酶作用卜的酶解率
TableZ一 14En刃          miehydrolysisrateofrieestrawbydifferentPretreatmentswithdifferenteellulase
酶解率(%)
预处理方式—
YT02纤维素酶诺维信纤维素酶夏盛纤维素酶
未处理一2.3一士一993*#一0.29士 2.0735.73士一098
1.0%HCI处理43.6狂2.354*#38.24士 3.34236.15士3.209
1.0%NaOH处理49.35士3.337#44.91士3.22一40.03士3.098
 l%HCI+l%NaOH63.51土5.643*#55.27士 3.48249.95士2.355
注:*,与相同预处理条件下诺维信纤维素酶相比,酶解率有显著性差异,只。.05;‘,与相同预处理条
件下夏盛纤维素酶相比,酶解率有显著性差异,P>0.05。
Note:*,    vsthegroupofNovo刃     meeellulaseinthesamepretreatment,p<0.05:#,    vsthegroupofxiasheng
    eellulaseinthesamePre加atment,P>0.05.
由表2-14可知:YT02纤维素酶、诺维信纤维素商品酶和夏盛纤维素商品酶对水稻秸秆原料直接酶解,酶解率都很低,水稻秸秆进行预处理后,酶解率显著提高;在不同预处理水稻秸秆原料中,以经酸碱复合处理的水稻秸秆最易于酶解,经碱处理的水稻秸秆次之。
YT02纤维素酶在酶解不同预处理水稻秸秆时,酶解率显著超过两种商品酶,是诺维信酶的1.09~1.19倍,夏盛纤维素酶的1.2~1.4倍。

3结论与讨论

3.1关于筛选出的纤维素酶高产菌株

采用纤维素刚果红平板法从云南高黎贡山原始森林腐殖中分离到纤维素高效降解菌YT01,其高产纤维素酶,并能将大量的纤维素酶分泌至细胞外。经原生质体诱变后得到突变株YTO2,其FPA、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活均值分别为 3.92Iu/mL、 228.47Iu/mL和1.36IU/mL,高于夏盛生物工程公司纤维素酶工业化生产菌株与公认高产纤维素酶的眼氏木霉3.3010,达到国内先进水平。
YT02能以水稻秸秆、玉米秸秆、玉米芯、玉米皮、白杨木和麸皮等木质纤维素原料为碳源发酵生产纤维素酶,以农作物秸秆尤其是水稻秸秆最适合YT02发酵产纤维素酶,这使水稻秸秆的生物高效利用成为可能。分别以未经预处理的水稻秸秆和经酸碱预处理的水稻秸秆为碳源发酵,发酵液纤维素酶活力无显著差异,可能的原因包括:(l)培养基在灭菌时,水稻秸秆的半纤维素和木质素部分降解,增加了纤维素和YT02接触的机会,从而诱导YTO2迅速产生纤维素酶;(2)发酵过程中YT02还能产生大量的氧化还原酶类,部分降解木质纤维素,从而诱导YT02产酶 ;(3)YT02发酵产纤维素酶对纤维素的诱导依赖性不强,添加不同量的微晶纤维素对YTO2产酶无显著影响也证明了这一点。水稻秸秆是农作物废料,量大而且集中,用作YT02产纤维素酶的碳源和诱导物,可以变废为宝,具有巨大的社会效益和经济效益。
采用豆饼粉和硫酸铵代替价格较贵的蛋白胨,作为YT02生产纤维素酶的氮源,不仅可取得较好的产酶效果,同时还节约了原料成本;在此基础上,添加麸皮和MgSO4能明显促进YT02的生长和纤维素酶的生产,而添加微晶纤维素对YT02产纤维素酶的影响不显著。
YTO2具有发酵产纤维素酶活高、能有效利用廉价的农作物废料水稻秸秆生产纤维素酶以及无需另外添加诱导剂等优势,因而有着广泛的工业化利用前景。

3.2纤维素酶生产菌的改造

要使纤维素酶真正能够用于工业生产,首先要降低纤维素酶的成本,因此,选育出高酶活的纤维素分解菌株就成了关键之一。新菌株的选育是纤维素酶科学研究的一个重要课题,诱变育种是其中的重要方法!’391。目前,对工业微生物菌株进行诱变,提高其基因的随机突变频率,并通过特定的筛选获得高产优质菌种,已经取得了巨大的成功,而且仍然是目前微生物菌种选育工作的重要手段。张等花等l”6]对菌种进行了诱变,提高了酶活力。王景林等对突变型黑曲霉M001经紫外线、亚硝基肌、TDP辐射仪及空间微重力辐射等因素诱变,其固体发酵纤维素酶活力大大提高。王成华等将里氏木霉A3经亚硝基肌和紫外线复合处理,获得了一株纤维素酶高产菌株91~3,该菌株在固体发酵的最适条件下,滤纸酶活力为170u/g曲。本工作对青霉YT01孢子进行紫外诱变,并未提高其产纤维素酶能力,采用YT01原生质体诱变,纤维素酶活力获得较大提高,经10代培养后发现每代的产酶能力接近,说明此菌株具有较好的遗传稳定性。这可能是由于采用饱子诱变时其饱子壁结构致密牢固,不利于诱变剂向核内渗透,诱变剂必须直接与核中DNA分子接触,反应才能达到目的;另一方面,诱变效果与细胞代谢活跃程度关系极大,只有代谢活跃,DNA处于复制状态才‘有利于基因突变。饱子代谢缓慢,容易造成基因突变频率低或因表型延迟效应而漏筛,而以原生质体为材料可能弥补了这两方面的不足。

3.3青霉YT02产酶条件与酶学特性

通过单因子发酵试验,获得YT02液体摇瓶发酵的产酶培养基(g/l):稻草粉,20;麸皮,10;豆饼粉,10;困H4)2504,2;装液量 100mL/soomL三角瓶,起始pH6.o。液体摇瓶发酵的产酶条件为:培养温度29℃,转速 200rpm,培养120h,纤维素酶各组分酶活均达到最高值。纤维素酶的粗酶液CMC酶和滤纸酶的最适作用温度均为50℃,热稳定性较好,50℃下作用24h各酶损失率小于20%;CMC酶的最适反应pH为4.8,滤纸酶的最适pH为5.0,这与其它己报道的真菌的发酵条件与酶学性质相似。
以粉碎至40目的不同纤维素原料,利用YT02发酵生产的纤维素酶进行酶解,以诺维信纤维素商品酶和夏盛纤维素商品酶为对照,发现天然纤维素原料直接进行纤维素酶解时,酶解率都很低,在20%以下。经酸碱复合预处理的水稻秸秆是YT02纤维素酶最佳酶解底物,酶解率达60%以上。酶解水稻秸秆时,YTO2纤维素酶水解率超过两种商品酶,是诺维信酶1.09~1.19倍,夏盛纤维素酶的1.2~1.4倍。由此可以推知,酶活力高低是影响酶解水平的主要因素,同时纤维素酶对酶解底物的可及性和纤维素原料化学成分的差异也是酶解的重要原因。
 

第三章YT02产纤维素酶发酵培养基的优化研究

获得产纤维素酶的优良菌株是纤维素酶高产的基础,而对发酵培养基进行优化是提高单位发酵液纤维素酶活的有效方法。微生物的生长和代谢产物的积累受培养基组成如碳源、氮源、无机盆、生长因子等多种因素的影响,如何快速地找出主要因子并进行优化并非易事。常规优化发酵培养基多采用将其它因素固定,每次改变一个因素的方法,这种方法费时、费力,并且由于因子间可能存在的交互作用而不能实现真正的最优化,且容易忽略因子lbJ的交互作用而得出错误的结论。响应面方法  (Responsesurfaeemethodology,RsM)是多变量系统寻优的试验策略,是利用合理的实验设计并通过实验得到一定数据,采用多元二次方程来拟合因素和响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺,解决多变量问题的一种统计学方法。与通常采用的单因子和正交实验无法找到整个区域上各个因素的最佳组合及响应值的最优值比较,RSM试验次数少、周期短,求得的回归方程精确度高,又能研究几个因素间交互作用,是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中实际问题的一种有效办法,目前已广泛地应用于农业、生物、食品、化学、制造等领域。
发酵培养基的优化首先是确定对发酵最可能具影响的营养和培养条件,然后用部分因子设计或Plackett-Burman设计进行筛选,去掉对发酵影响不显著的因素,对保留的因素用响应面方法进行优化,建立的模型(通常为二次多项式)用于预测获得最大期望响应的水平。本研究以水稻秸秆为主要碳源,豆饼粉为主要氮源,首次利用响应面方法对影响YT02产生纤维素酶的发酵培养基主要因子进行了筛选和优化,为纤维素酶的工业化生产奠定一些实验基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂
水杨素、竣甲基纤维素钠购买自SIGMA公司;试验中所用其它试剂均为分析纯。
1.l.2供试菌种
青霉YT02:本实验室分离改造。
1.1.3培养基
斜面培养基:PDA培养基。摇瓶发酵培养基(g/l):水稻秸秆粉;麸皮;豆饼粉;(NH4)2S04;MgSO4;起始 pH6.0。
1.1.4主要仪器与设备
 Eppendorf Bio-photometer分光光度计;ZHWY- 211D型恒温培养振荡器;CJT-16洁净工作台;PHS-9V型酸度计;Sartorius电子天平;SANYO恒温培养箱;Eppendorf centrifuge5804R离心机;LDZX-4OBI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器;Electrolux冰箱。

1.2方法

1.2.1实验设计
1.2.1.1部分因子试验设计  (FraetionalFaetorialDesign)
根据第二章的研究,选取6种营养成分,每种成分作为一个因子,选用26-2两水平的部分因子试验设计,需要16次实验,加上中心点四次重复试验,在本研究中选择20次实验设计。
1.2.2.2中心组合设计(CentralCompositeDesign,CCD)
中心组合设计参照文献进行。用Expert Design7.1.3对实验数据进行分析,得到二次多项式,该方程为描述响应量(应变量)和自变量关系的经验模型。对于3因子系统,模型可描述为:
Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+bl3X1X3+b23X2X3+b11X12+b22X22+b33X32
其中Y为预测响应值:Xi为独立变量的编码值;b0为截距;bl,b2,b3为线性系数;bl2,b13, b23为交互作用系数;bl1,b22,b33为平方系数。对方程所代表的响应面进行分析,优化的方程确定在临界值下的预测响应值是否为球面最大,球面最小或马鞍面。如果在实验范围内球面最大(或最小),则进行验证实验。如果最大值(或最小值)在实验范围之外,则进行脊分析,确定在什么方向进行实验可得到更好的结果。在本研究中,Y1表示滤纸酶,Y2表示CMC酶,Y3表示β-葡萄糖苷酶。用实验设计软件  Expert Design7.1.3对实验数据进行分析。
1.2.2培养方法
将上述菌种接种于斜面培养基上,在30℃培养4~6d后使用。 500mL摇瓶装  100mL发酵培养基,经121℃灭菌 30min,接种用生理盐水冲洗的孢子 1mL(孢子数约为107个/mL),28℃旋转式摇床上振荡 (200r/min)培养5~6d,离心上清液即为粗纤维素酶液。
1.2.3分析方法
1.2.3.1 pH的测定:用PHS-9V型酸度计测定。
l.2.3.2残余还原糖的测定:DNS法。
l.2.3.3酶活力的测定:见第二章1.2.7。
 

2结果与分析

2.1部分因子实验筛选发酵培养基的主要影响因子

第二章的单因子试验确定了影响YT02液体发酵产纤维素酶的可能培养基成分,包括水稻秸秆、麸皮、豆饼粉、(NH4)2504和MgsO4。另外,KHZP04在培养基中能起一定缓冲作用,避免培养基酸度的快速增加,影响细胞生长;同时,P是蛋白质、核酸的组成部分,也是ADP、ATP和细胞膜的组成部分,添加KHZPO4有助于生物量的积累和产酶。因此对这6个因素进行全面考察,选用26一2部分因子实验设计,以YI、YZ和Y3三个反应值分别代表FPA、cMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。并设4个中心点重复实验用于t一检验。每个因素取高(+l)、低(-l)两个水平。用 Expert Design7.1.3软件分别计算各因素的效应值,用   SPSS 11.0软件对各因素效应进行t-检验,选择显著因素作进一步考察。
以水稻秸秆为主要碳源,豆饼粉为主要氮源,添加麸皮、(N执)2504、MgSO4和KHZPO4,选用26-2部分因子实验设计,各因子编码值及实验设计和实验结果见表3-1和表3-2。对实验结果进行ANOVA分析,结果见表3-3~表3-5。
从表3 3~表3-5可以看出:水稻秸秆(Xl)和豆饼粉(X2)浓度对YT02所产纤维素酶的各组分影响极其显著,麸皮添加量(X6)对YT02所产纤维素酶的各组分影响显著,而(NH4)2S04、MgSO4和KH2PO4浓度对YT02产纤维素酶各组分的影响均不显著。
表3-1部分因子实验设计及编码值
Table3一     1Listofeodedfactorsoffaetorialdesign
各因子水平
因子—
一 101
水稻秸秆(g/L,  X!)102030
豆饼粉(g/L,  XZ)51015
MgSO4(g/L,  X3)0.30.50.8
伽氏)2504(g/L,为 )246
KHZP04(g/L, Xs)246
麸皮(g/L,X6)5’ 1015表3-2部分因子实验设计及实验结果
Table3一       2ExPerimentaldesignsandtheresultsoffaetorialdesign
序号   XIX:X3X4XSX6Y!Y:Y3
单位g/lg/Lg/Lg/lg/Lg/LIU/mLIU/mLIU/mL
一 14.46士1.229186土12.3321.47士0.113
 4.91士  0.997198土 16.2471.82士0.099
 5.06士   1.112193士 17.8872.05士0.876
 5.11士  1.085216士 15.5322.25士0.116
 4.82士   1.067175士 10.6121.72士0.005
 4.83士   1.003182土 12.9941.83士0.012
一 14.84士0.982183士17.9391.94士0.003
一 14.98士1.008185士13.3481.82士0.002
 4.77士  1.112177士 13.4381.69士0.011
 14.98士1.075
一 14.93士1.009
195士 16.3751.76士0.017
183士 15.3641.84士0.015
一 14.98士1.042197士18.7642.18士0.025
一 14.51士1.008178士16.7851.7士0.003
一 15.08士1.021185士19.9631.86士0.002
 5.13士 0.96219见  17.3392.05士0.013
 5.27士  1.113
 5.03
233士  20.4512.31士0.003
    000000
 4.98
 5.01
201
198
 1.96
 2.01
20193
                1518191314161710111224936578
         200000005.061991.97
丫1:F以;丫2:CMC酶活;丫3:β-葡萄糖苷酶活,17一20为中心点的四次重复。
 Y.:FPA;YZ:CMCaseactivity:Y3:β-glueosidase即tivity,  thevaluesofNo,17一     20aretheresultsoftheeentral
    PointforfourrePeatedexPeriments.表3一3部分因子试验ANOVA分析结果(resPonsel,F队)
Table3一      3AnalysisresultsofANOVAProeessingoffactorialdesign(resPonsel,FPA)
5011代e平方和自由度均方差Estimate
Model
Α-水稻秸秆
 0.50
 0.16
 0.17
 0.16
 4.92 0.0010
B一豆饼粉
F一麸皮
 0.24
 0.010
 0.24
 0.010
 0.10
 0.12
 0.0067
 0.0020
  0.0800.0238
表3-4部分因子试验ANoVA分析结果(responseZ,CMC酶活)
Table3一      4AnalysisresultsofANOVAProeessingoffactorialdesign(resPonseZ, CMCaseaetivity)
SoufCe平方和
2775.25
自由度
Model
Α-水稻秸秆
B一豆饼粉
F一麸皮
均方差
693.81
Estimate
191.56 0.0008
855.56
798.06
855.56
798.06
 7.31
 7.06
 0.0038
 0.0047
351.56 351.564.69 0.039
表3-5部分因子试验ANov^分析结果(:esponse3,β-glucosidase酶活)
Table3一      5AnalysisresultsofANOVAPr℃essingofFactorialDesign(resPonse3,β- glueosidaseaetivity)
Souree平方和自由度均方差EstimateP
      ModCI0.6030.201.890.0002
Α-水稻秸秆     0.1210.120.0860.0110
B一豆饼粉    0.4210.420.160.0001
F一麸皮    0.06610.0660.0640.0433
对实验组数据平均值与中心点实验数据的平均值进行t-检验,结果见表3-6。
表3-6T统计量检验结果表明,在方差相等和方差不等的条件下,中心实验点和部分因子实验平均值差异均不显著(表3-6),说明实验的最优点(纤维素酶活性最大)不在当前实验的设计范围之内,需应用最陡爬坡法寻找实验的最优空间。表3-6平均值t-检验
Table3-6t-   TestforEqualityofVariances
方差
类别自由度(df)519.(2一tailed)
 (Equalvarianees)
 0.355
 0.081片月‘J广6
    270606888assumed
FPA
 notassumed
assumed
l7
CMC酶活
 notassumed
aSSumed
l6
 0.307
 0.051
β-葡萄糖苷酶活
 notassu们ned17
 0.526
 0.221

2.2最陡爬坡实验逼近发酵培养基最优点

由表3-3~表3-5的ANOVA分析结果可以确定下一步实验的最陡爬坡路径:MgS04、(NH4)2S04和KH2PO4浓度对YT02产纤维素酶的影响不显著,固定在中心点水平。水稻秸秆和豆饼粉对YTO2产纤维素酶的影响极显著,麸皮对YTO2产纤维素酶的影响显著,且Estimate值都为正,说明增加水稻秸秆粉、豆饼粉和麸皮的浓度均对YT02产纤维素酶有积极的影响,水稻秸秆粉每次增加3g/l,豆饼粉每次增加2.76g/L,麸皮每次增加2.22g/L为基本步长(△)。则最陡爬坡实验及结果见表3-7。
表3-7最陡爬坡实验设计与实验结果
几ble3一        7ExPerimentaldesignandtheresultsofsteePestaseent
 TrialXI(g/l)XZ(g/L)X6(g/L)YZ(IU/mL)
Origin
 stePlong
l
l5
 2.76
Y一(IU/mL)
 4.83士0.723185.64士17.756
Y3(IU/mL)
 3.86士0.243
17.76
20.52
17.22
19.44
 5.67士 1.761
 6.52士 1.883
222.35士 20.0032.13士0.012
278.66士 22.0342.68士0.041
 23.287.29士    1.007317.81士 16.7343.17士 0.117
 26.046.74士  1.013302.53士 25.0423.01士0.021
    42303933363
内、以4
 6.51士   1.119286.46士 22.7782.8社0.012
 5.92士 1.152251.87土 21.0762.66士0.017
  668832.1  21.23.28.26
3l.2856.8︸、 JOQ峥月月,︸、︸麦U
Yl:FPA;YZ:cMc酶活:Y3:β-葡萄糖苷酶活。
Y, :FPA;YZ:CMCaseactivity:Y3:β- glueosidaseactivity.
从表3-7可以看出,处理3对应的纤维素酶三个组分活性均为最高,CMC酶活、FPA和葡萄糖苷酶活均值分别为 7.29IU/mL、 317.81IU/mL、3.17IU/mL。随后酶活性开始降低,因此选择处理3的三种底物浓度做优化实验。

2.3中心组合设计优化YT02发酵培养基组成

由上述最陡爬坡实验结果可得响应变量(FPA,CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活)值接近最大响应值区域,以处理3的培养基组成为原点进行响应面分析,实验设计及结果分别见表3-8,表3-9,中心组合实验结果分析见表3-10~表3-12。
表3-8中心组合实验因子与水平的设计
Table3一      8FaetorsandlevelsofeentraleomPositedesign
水平
因子—一——-----一—
一 1.682一    1011.682
水稻秸秆(g/L,     XI)22.1829394455.82
豆饼粉(g/L,    XZ)14.8718.2823.2828.2831.69
麸皮(g/L,    X6)13.2516.6621.6626.6630.07
对实验数据进行多项式回归,可以得到如下二次多项式方程:
  YI=8.90+1.07*X一+0.46*XZ+0.15*兀+0.24*X一*XZ一0.096*X一*X6+0.049*XZ
*x6一 0.90*xlZ一0.95*x22一0.71*x62-----------------一(l)
YZ=357.41+35.13*X一+15.71*凡+8.28*X6+1.70*X一*XZ一2.38*X一*X6一1.89*XZ
*x6一37.30*x,2一32.21*xZ,一24.64*对-------一(2)
 Y3=3.70+0.53*XI+0.26*XZ+0.12*凡+0.24*XI*XZ一0.067*X一*X6一0.43*XI
  0.56*x22一 0.39*X62---------------------------------一(3)
由方程(l)一(3)的二次项系数特征可知,方程表征的抛物面开口向下(见图3一l、
图3-2、图3-3)。表3-9中心组合设计结果
Table3一     9ResultsofthecentralcomPositedesign
StdFaCtorlFaCtofZ  Faetor3ResPonselResPonseZResPonse3
X一 XZX6Y一 YZY3
 4.5士  0.925183.32士 12.3741.41士0.016
 6.48士  1.023268.64士20‘ 0692.22士0.125
 5.3士 0.067248.36士 24.3751.81士0.002
 8.02士  1.983301.45士 22.4313.29士0.075
 5.12士  1.027236.69士 26.5782.05士0.004
 6.5士  1.006273.45士 24.2182.29士0.015
 5.9士 0.293255.16士 21.0562.15士0.003
 8.45士  1.317337.74土 27.0733.66士0.006
一 1.68 4.6士  0.077186.12士 15.0261.47士0.001
68 8.15士 0.169318.15士 23.3713.41士0.024
一 1.68
 1.68
 5.8士 0.085256.43士   18.4261.9士0.003
 6.52士 0.074276.61士 19.9462.27士0.002
nU︸0︸
一 1.68 6.8土 0.059284.41士 28.6052.51士0.004
68 7.0壮 0.082291.45士 25.0042.63士0.011
 8.78士 0.025359.58土 24.4613.72士0.029
︹U︶八U
8士 0.003303.71士 26.0463.56士0.007
 8.52士 0.010339.8肚 28.5943.39士0.018
n︶︷O
 8.82士 0.099364.6肚 25.5253.8肚0.022
 9.85士 0.283397.38士 26.4814.06士0.044
 9.4士   0.315379.2肚 29.0453.65士0.026
,"乡落.)尸,7宝少八UI,自,J呀哎月Jl‘ Utol八︸n,︸n︸
;…!、         ..111.1111111......!,产‘
Y.:rp^;YZ:CMC酶活:Y3:β-葡萄糖苷酶活。
 Y::FPA:YZ:CMCaseactivity;Y3:β- glueosidaseactivity.表3一10中心组合实验设计ANOVA分析结果(YI)
Table3一     10ResultsofANOVAanalysisofCCD(YI)
SollfCe平方和
46.88
自由度均方差Estimate
Model
Α-A15.61l5
 8.9
 1.07
 <0.0001
 <0.0001
B一B 2.89
 0.31
 0.46
 0.15
 0.0094
 0.3146
11.勺到n丫,1.2].6邵引
 0.46    0.460.240.2314
 0.074
 0.019
 0.074
 0.019
一 0.096 0.6!86
 0.049 0.8
  11.74
13.8
74 <0.0001
98 <0.0001
nU、I.J、0L、j劝.且
  7.267.26一 0.71 0.0005
  C-CACABBC扩守d
表3-10中心组合实验设计ANOVA分析结果(Y:)
Table3一     11ResultsofANOVAanalysisofCCD(YZ)
SollrCe平方和自由度Estimate
Model 58085.46357.40760.0012
Α-A16856.39 35.132330.0008
B一 B3370.54915.709960.0605
936.8066  8.2822750.2908
23.08601 1.69875 0.8645
45.45811一 2.38375 0.8109
28.46351
20047.41
一 1.88625 0.8497
一37.2973 0.0004
14952.84
8750.856
均方差
6453.94
16856.39
3370.549
936.8066
23.08601
45.45811
28.46351
20047.41
14952.84
8750.856
一 32.2115  0.0012
一24.6419 0.0067
  C-CABACBC扩扩d表3一12中心组合实验设计ANOvA分析结果(Y3)
Tab】e3一    12ResultsofANOVAanalysisofCCD(Y3)
Souree自由度均方差Est加ale
MedCI
平方和
13.36 <0.0001
Α-A 3.90
  1.483.70
  3.900.53 <0.0001
B一 B0.93
 0.19
 0.93
 0.19
 0.26
 0.12
 0.0034
   0.1136
    0.470.470.240.0219
0.036
 0.000
0.036
 0.000
一0.067
000
 0.4680
 1.000
  2.692.69一 0.43 <0.0001
 4.47
 2.14
 4.47
 2.14
一 0.56
一 0.39
 <0.0001
 0.0002
  C-CABACBC尸矛d
(A)(B)
证川.....
p!荀萄旅节蕊活
q弓、,1︶
(C)
Fig
图3-1水稻秸秆和豆饼粉对各酶活的中心组合相应曲面图
3一 1ResponsesurfaeePlotsofXI胡dXZonA,BandCPr
、:二.‘一十热而图,I一户笔目下宁,执1份川曰一一
oduetion
A:FPA酶活;B:叨C酶活;C:β-葡萄糖苷酶活。
A:FPA;B:CMCase朗tivity;C:卜 glucosidaseactivity·囚

试℃
·,仍·1加
(B)(C)
图3-2水稻秸秆和麸皮对各酶活的中心组合响应曲面图
Fig.3一  2Responsesuri触  cePlotsofX一  andX6onA,   BandCPreduetion
A:「队酶活;B:CMC酶活;C:β-葡萄糖苷酶活。
 A:FPA:B:CMCaseactivity;C:β- lueosidaseactivity.
(A)为g/l328397伪J-‘........
.1川·,加
(B)
..、‘心﹄‘曰︸‘,..,洲nll﹃‘呀
p·酶活萄枪昔荀
J加.!加
(C)
图3-3豆饼粉和麸皮对各酶活的中心组合响应曲面图
Fig.3一       3ResponsesurfaeePlotsofXZandX6onA,   BandCProduetion
A:「PA酶活;B:哪C酶活;C:β-葡萄糖苷酶活。
 A:FPA:B:CMCaseaetivity:C:β- glueosidaseaetivity.
从图3-1~图3-3可以看出,响应值存在极大值点,经计算得到方程的确定系数好分别为0.9435、0.8852和0.9542,表明该模型能够较好地解释纤维素酶三个组分的活性变化。
经 Design Expert7.1.3计算,确定了水稻秸秆、豆饼粉和麸皮在培养基中的最优组合(见表3-13)。
表3-  13Expert Design分析寻求稳定点
Table3一        13StationaryPointPredictionbyexPertdesignanalysis
Na们    neGoalLimitLimit50!utions
 InfangC
 111faflgC
  41.95
 lflfallgC
nlaXI】nlZe
24.83
22.16
  9.858.8967
nlaXI】】11Ze183.32397.38357.408
-,乙护O-,‘   XXXYY
     Y3maximize1.414.063.7042
置信水平0.905
由表3-13可知:当水稻秸秆为41.95g/l、豆饼粉为24.83g/l和麸皮为22.16g/l时,YT02发酵产纤维素酶的活性最高。FPA、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活分别为8.8967IU/mL、357.41IU/mL和 3.704IU/mL。三次重复发酵实验,验证的发酵,与模型预测值较为接近,说明该模型较为可靠。经响应面分析获得的优化培养基组成为:水稻秸秆为 41.95g/L,豆饼粉为 24.83g/L,麸皮为 22.16g/L,(NH4)2S04、KH2PO4为 4g/L,MgSO4为0.5g/L。

2.4发酵过程中pH、残余还原糖与纤维素酶变化的测定结果

根据上述实验结果,选择如下摇瓶发酵培养基:水稻秸秆为 41.95g/l,豆饼粉为24.83g/L,麸皮为 22.16g/L,伽H4)2504、KHZpO4为 4g/L,MgsO;为 0.5g/L。起始 pH6.0,500mL三角瓶装液量 100mL。每隔4h取样一次,研究pH和纤维素酶活性的变化,结果见图3-4、图3-5和图3-6。
从图3-4可以看出,YT02在摇瓶发酵过程中,pH先是缓慢下降,在经过12h的延滞期后迅速下降,在4Oh时达到最低值3.%,接着上升,在64h达到最大值 5.39。之后略有起伏,但pH值一直维持在5.0以上,发酵终点的pH值为5.34。残余还原糖先下降,这可能是菌体生长消耗的结果,在44h一52h出现快速上升,YT02在此阶段开始产生一定量的水解酶,将水稻秸秆粉降解为还原糖,但随着发酵的进行,还原糖逐渐被菌体消耗。
图3-4摇瓶发酵过程中残余还原糖与pH值的变化
图3-5摇瓶发酵过程中FPA、CMC酶活的变化
注:*,与摇瓶发酵开始产酶的时间相比(24h),酶活有显著性差异,P>0.05。NOte:*vs the starting time with enzy    me activity in shaking fermentation(24h),p>0.05。
从图3-5和图3-6可以看出:YT02发酵24h开始产生纤维素酶,48h~96h为大量产酶阶段,96h后纤维素酶稍有上升, 112h后酶活开始下降,故以YT02发酵周期以 112h为宜。
FPA和β-葡萄糖苷酶活的变化规律与CMC酶活相似,这与刘小杰和李忠兴等报道的康氏木霉所产纤维素酶的性质一致。
图3-6摇瓶发酵过程中β-葡萄糖苷酶的变化
注:*,与摇瓶发酵开始产酶的时间相比(24h),酶活有显著性差异,P>0.05。
 

3结论与讨论

本实验将响应面分析法用于YT02产纤维素酶培养基组成的优化,取得了良好的效果。证明了响应面方法优化发酵培养基十分有效,利用部分因子实验可以快速找出影响发酵产酶的主要因子:并为最陡爬坡法指明方向,使实验值能充分接近最大响应面区域,中心组合实验能够快速对主要影响因子进行优化,得到最大响应值。青霉YT02同其它纤维素酶高产菌株一样,能利用常见的农业废弃物作为培养基的主要组分,尤其是水稻秸秆,相对于其它碳源,水稻秸秆中含有40%左右的纤维素,整个纤维结构较松散,对诱导YT02产纤维素酶效果比较理想,而稻草粉在培养基中添加一定量的麸皮,可以为菌体生长生长因子,如维生素、嗓吟和微量元素等,有利于YT02产纤维素酶。实验结果也证明:水稻秸秆与麸皮之间存在明显的交互作用。水稻秸秆、麸皮和豆饼粉浓度对YT02纤维素酶的产生有显著影响。在一定浓度范围内随着它们浓度增加纤维素酶各组分酶产量增加。最陡爬坡实验结果显示过高的底物浓度对YT02纤维素酶的产生有抑制作用,引起这种结果的原因可能是因为过高的底物浓度使得发酵液粘度增大,不利于溶氧和物质交换。发酵培养基在工业化生产中起着非常重要的作用,这也是工厂将其视为商业机密的原因,如何获得更优的发酵培养基是生产高水平纤维素酶的关键因素之一。
在培养基优化前FPA、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活分别为 3.92IU/mL、 228.47IU/mL和 1.36IU/mL,经优化后,上述酶活分别达到了 8.8967IU/mL、 357.41IU/mL和 3.704IU/mL;分别为优化前的2.27倍、 1.56倍和2.72倍。经响应面分析获得的优化培养基组成为:水稻秸秆为41.95g/L,豆饼粉为24.83g/l,麸皮为22.16g/l, (NH4)2S04、KH2PO4为4g/l,MgSO4为0.5g/L;起始pH6.0。
本工作采用 EXPERT DESIGN设计结合SPSS统计分析,获得了发酵培养基成分的二次多项式数学模型,在一定浓度范围内随机取点做验证试验,试验结果能较好地符合二次多项式数学模型,证明了这些模型的正确性和可靠性。FPA、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活的数学模型分别为:
Y1=8.90+1.07×X1+0.46×X2+0.15×X6+0.24×X1×X2-0.096×X1×X6+0.049×X2×X6- 0.90×x12-0.98×X22-0.71×X62
Y2=357.41+35.13×Xl+15.71×X2+8.28×X6+1.70×X1×X2-2.38×X1×X6-1.89×X2×X6-37.30×X12-32.21×X22-24.64×X62
 Y3=3.70+0.53×X1+0.26×X2+0.12×X3+0.24×X1×X2-0.067×X1×X6-0.43×X12- 0.56×X22-0.39×X62
 

第四章YT02分批发酵产纤维素酶的研究

纤维素酶生产的发酵放大是利用纤维素原料工业化生产燃料乙醇的关键步骤之一。摇瓶发酵与发酵罐发酵存在着很大的差别,主要有以下几个方面:(l)体积氧传递系数和溶解氧的差异。发酵罐采用通入无菌压缩空气的方法提供氧气,通过调节空气流量和搅拌桨转速调节体积氧传递系数和发酵液中溶解氧水平,而摇瓶则通过瓶口的介质扩散提供氧气,可通过增加摇床转速或降低摇瓶装液量来提高摇瓶的溶氧水平,因此,通常发酵罐的溶氧水平高于摇瓶。(2)二氧化碳的差异。二氧化碳是细胞能量代谢的产物,其溶解度与压力有关,随着发酵罐压力的增加,二氧化碳浓度的增加比氧气增加速度要大,因此发酵罐中的二氧化碳浓度比摇瓶的要高。二氧化碳溶解度的变化将引起能量代谢和发酵液pH值的改变,从而影响目标产物的产量。(3)剪切力不同。发酵罐采用机械搅拌增加溶氧水平,剪切力与搅拌桨转速和半径的平方成正比,因此发酵罐中微生物受机械剪切力的程度比在摇瓶中大。特别是丝状真菌等丝状微生物,对剪切力十分敏感。剪切力还会影响菌丝团的直径,从而影响传质和生物反应。(4)混合的差别。摇瓶中的混合效果一般都比较好,在发酵罐中,随着规模的扩大,混合时间增加,发酵罐的某些区域会存在死区,溶氧、底物浓度、产物浓度和微生物浓度等不可避免地会存在空间分布。
摇瓶发酵与发酵罐之间的差别,及不同规模发酵罐之间的差别是造成发酵过程“放大效应”的主要原因。本章拟研究温度和溶氧对YT02纤维素酶发酵的影响以及发酵过程pH值的变化,为生产菌创造一个最适的环境,提高目标产物纤维素酶的产量;研究纤维素酶发酵从摇瓶到SL发酵罐分批发酵的放大问题,以期确定最佳分批发酵工艺条件。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂
CMC-Na购自SIGMA公司,其它试剂为国产分析纯。
1、1、2菌株
青霉YT02:本实验室分离培养。
1.1.3 培养基
斜面培养基:PDA培养基。
种子培养基(g/L):蛋白胨,3;麸皮,20;葡萄糖,10;微晶纤维素,1;水稻秸秆,5;(NH4)2SO4,3;pH自然。
发酵培养基(g/L):水稻秸秆,41.89;豆饼粉,24.82;麸皮, 22.11;(NH4)2S04,4;KH2PO4,4;MgSO4,0.5;起始 pH6.0。
1.1.4主要仪器
LDZX-40BI型立式自动电热蒸汽灭菌锅;HZQ-QX全温振荡器;Bioteeh-SBG型SL全自动控制发酵罐 ;EppendorfCentrifuge5417R离心机;TGL-16型离心机;sartrious电子天平:LRH一-250A生化培养箱;紫外可见分光光度计;PHS-gV型酸度计。

1.2方法

1.2.1用于分批发酵的种子培养
种子培养基装液量为50mL/soomL三角瓶,接活化后的种子1环,29℃,转速200甲m,摇床培养24h。
 1.2.2恒温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响
使用上海保兴生物设备工程有限公司生产的Biotech一SBG型SL全自动控制发酵罐进行分批发酵。发酵罐容积SL,两层六平直叶搅拌,三挡板。装料系数0.6,接种最5%,通气量 0.5om,搅拌转速 400rpm,初始pH6.O,设置不同的发酵温度,即35℃、32℃、29℃和26℃分别进行分批发酵。发酵过程中流加泡敌消泡,复膜氧电极和pH电极在线测定发酵过程中的溶解氧和pH变化。每隔sh取样,测定纤维素酶活性及菌体生长情况,记录发酵过程pH值的变化情况。菌体生长速率=d(核酸含量)/dt;酶生成速率=d(纤维素酶活力)/dt。
 1.2.3变温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响
使用上海保兴生物设备工程有限公司生产的Bioteeh一SBG型SL全自动控制发酵罐进行分批发酵。装料系数0.6,接种量5%,通气量 0.5om,搅拌转速 400rpm,初始pH6.0,在分批发酵培养前期0~30h采用32℃发酵,30h至发酵结束采用29℃发酵,发酵过程中流加泡敌消泡,复膜氧电极和pH电极在线测定发酵过程中的溶解氧和pH变化。每隔8h取样,测定纤维素酶活性,观察纤维素酶活性的变化。
 1.2.4溶氧量对YT02分批发酵产纤维素酶的影响
使用上海保兴生物设备工程有限公司生产的Bioteeh-SBG型SL全自动控制发酵罐进行分批发酵。发酵罐容积SL,装料系数0.6,接种量5%,通气量 0.5om,发酵培养前期O~30h采用32℃发酵,30h至发酵结束采用29℃发酵,初始pH6.0,发酵过程中流加泡敌消泡,复膜氧电极和pH电极在线测定发酵过程中的溶解氧和pH变化。在不同溶氧条件下,每隔8h取样,测定纤维素酶活性及菌体生长情况。
 1.2.5分段溶氧对YT02分批发酵产纤维素酶的影响
发酵罐容积SL,装料系数0.6,接种量5%,通气量 0.5om,发酵培养前期0~30h采用32℃发酵,30h至发酵结束采用29℃发酵,初始pH6.o,发酵过程中流加泡敌消泡,复膜氧电极和pH电极在线测定发酵过程中的溶解氧和pH变化。在0~32h时控制溶氧70%;32h至120h发酵结束控制溶氧50%,每隔8h取样,测定纤维素酶活性及菌体生长情况。
1.2.6分析方法
1.2.6.1生物量测定
由于发酵介质中含有固体基质,菌丝体无法通过离心或过滤的方法与培养基分离,无法以菌丝干重法计量生物量,本实验通过测定单位体积发酵液中的核酸含量来表征菌体的生长情况。
取发酵液2mL,3000r/min离心15min。弃上清液,沉淀物在2mL冰冷的10%二氯乙酸中悬浮,在冰上静置 3min。3000r/min离心悬浮液15min,取上部球粒悬浮于 2mL 5S%三氯乙酸中,缓慢加热到100℃,冷却到室温, 3000r/min离心15min,用水稀释 0.1mL上清液到 5.0mL。于260nm处测OD,按照如下公式计算核酸含量:
核酸含量(g/L)=l.72×A260
l.2.6.2PH测定
发酵罐中培养时,pH由发酵罐内电极测定。
1.2.6.3酶活力测定见第二章1.2.7。

2结果与分析

2.1发酵温度对YT02产纤维素酶的影响结果

从不同发酵温度下YT02摇瓶发酵的结果可以看出,发酵温度对YT02产纤维素酶影响显著,因此批处理试验也必须考察温度对发酵过程的影响。分批发酵采用不同的发酵温度即35℃、32℃、29℃和26℃,研究发酵温度对YT02在生物反应器内细胞生长和纤维素酶生产的影响。不同发酵温度下的分批发酵培养过程曲线见图4-1(A)(B)(C)(D)。一

 
 
图4-l不同发酵温度下的YT02分批发酵进程
从图4-1可知,发酵温度对YT02的生长速率及产酶均有显著影响(P>0.05)。随着温度升高,到达最大生物量和最大酶活力时间被缩短。在前28h内,较高温度下(35℃)细胞生长较快,但在培养24h后,生物量开始下降,而较低温度(32℃、29℃和26℃)的生物量却在上升。最大生物量出现在较低温度32℃,尽管要比35℃培养的时间滞后近8h。当在35℃培养时,纤维素酶的合成滞后于细胞生长约30h,之后开始迅速上升。但是对于32℃和29℃来讲,滤纸酶和CMC酶在培养40h后才能进入酶活力快速上升期,β-葡萄糖苷酶在培养48h后才进入酶活力快速上升期,且上升速度较快,这可能是由于水稻秸秆小部分水解诱导了β-葡萄糖苷酶的产生。在培养的前半程,35℃培养酶活力均高于32℃和29℃组的酶活力。但是在培养的中后期,29℃培养获得酶活力最高。而且,在29℃培养时观察到,在达到酶活力高峰后,保持稳定期时间更长些。可见升高温度有利于细胞的生长,但温度升高有时会加速细胞自溶和酶的失活;而低些的温度有利于纤维素酶的合成和分泌。
然而,发酵过程的温度也不宜过低,因为降低温度就明显地降低了生化反应的速率,延长发酵周期,26℃时虽然培养120h后纤维素酶还在不断的合成,但合成速率很低,所提高的纤维素酶活不足以抵偿生产成本。根据以上分析,可以看看出32℃和29℃分别有利于该菌的生长和产酶。
不同发酵温度下培养液pH值的变化情况见图4一2。由图4一2可知,不同发酵温度对发酵液pH值的变化无显著影响,YT02分批发酵pH总的变化趋势为:接种 16h左右细胞经过延滞期后生长进入快速增长期,发酵液pH急剧下降,最低pH值达3.7左右,随后pH值缓慢上升至5.0以上,维持一段时间后pH略有下降并开始大量产酶,产酶后期pH又回67复上升的趋势,直到发酵结束。从不同温度条件下发酵的结果可以看出,提高培养温度对缩短细胞延滞期有一定的作用,对细胞生长有明显的促进作用,35℃培养24h就达到最低pH点,而29℃和26℃培养达到最低pH点的时间为28h一32h左右,pH值与细胞生长速率成一定的镜像关系。目标产物纤维素酶在pH缓慢上升时开始形成,pH升高到5.0以上时进入快速合成期,在60h进入产酶高峰期,120h左右达到最大酶活力,并且产酶高峰期稳定。在发酵后期,随着基质的消耗以及代谢副产物的积累,生长微环境的变化,菌体部分自溶,导致pH值上升,势必会影响纤维素酶的合成和分泌,不再适合于纤维素酶的积累。
图4-2不同温度卜YT02分批发酵过程中pH值的变化

2.2变温发酵对YT02产纤维素酶的影响结果

在YTO2变温分批发酵过程中,培养前期O~30h采用32℃发酵,30h~ 1ZOh发酵结束采用29℃发酵,测定发酵液纤维素酶活性,与恒温分批发酵120h发酵液纤维素酶活性进行比较,结果如表4-l。
从表4-1可以看出,不同发酵温度对YT02产纤维素酶影响显著,发酵 120h,采用变温发酵时YT02发酵液纤维素酶活性高于恒温发酵。说明在分批发酵的前期适当高的温度(32℃)有利于YT02的生长和生物量的积累,而略低的温度(29℃)则有利于该菌产纤维素酶。当YT02在生长和产酶的较佳状态时发酵,纤维素酶活力有显著提高。
68表4-l变温发酵对YT02产纤维素酶的影响
发酵温度FPA(IU/mL)eMC酶活(IU/mL)β-葡萄糖首酶活(IU/mL)
26℃ 6.973士0.609298.45士10.997 2.987士0.986
29℃10.041士1.348402.67士  17.8763.596土0.162
32℃ 9.382土1.223396.22士15.425 3.455士0.122
35℃ 8.265士 1.009377.58士14.256 3.082士 0.178
32℃(0一32h)
10.864士1.875438.61士17.978*尽 3.947士 0.164*岸
29℃(32一120h)
注:*,与29℃恒温发酵相比,酶活有显著性差异,P>0.05;#,与32℃恒温发酵相比,酶活有显著性差异,P>0.05。

2.3溶氧对YT02产纤维素酶的影响结果

固定通气量 0.5vvm,采用控制搅拌转速的方法来改善培养过程中的氧供给,发酵培养前期0~30h采用32℃发酵,30h至发酵结束采用29℃发酵,研究搅拌转速对YT02分批发酵产纤维素酶的影响。结果见图4-4、图4-5和图4-6。IU·h-1,g·L- 1·h-1
转速、菌体量(核酸)与产酶速率关系图(DO:70%)
图4一4溶氧70%条件下的YT02发酵进程
 
转速、菌体星(核酸)与产酶速率关系图(00:50%)
图4-5溶氧50%条件下的YT02发酵进程
转速、菌体欣(核酸)与产酶速率关系图(D0:30%)
图4-6溶氧30%条件下的YT02发酵进程
由图4-4、图4-5和图4一-6可知,发酵初期,随着菌体的旺盛生长,需氧量迅速增加,搅拌转速提高,摄氧率出现一个高峰,同时菌浓度也出现一个高峰。此后开始产酶,产酶阶段明显滞后于菌体生长阶段,证明产酶反应属于次级代谢类型,产酶过程溶氧上升并维持,而不是保持相对稳定或者下降。此高需氧阶段恰好与产酶的旺盛阶段对应。这与产酶阶段细胞大量合成酶蛋白,需要大量的氧气相一致。在这一阶段生长趋于停止,菌体浓度变化也不大,因此生长项和菌体维持项应呈下降趋势或变为零,而耗氧率的明显提高说明产酶反应是明显的需氧过程。发酵后期发酵液的溶氧浓度缓缓上升,如果菌体自溶发生,则发酵液的溶氧浓度上升更加明显。因此在整个发酵过程中出现了二次摄氧高峰,证明YT02纤维素酶发酵在菌体繁殖和产酶过程中都需要氧的直接参与。
对上面三个试验,分别测定了不同培养时间的生长速率和产酶速率(表4-2)以及发酵120h发酵液的酶活力(图4-7)。
表4-2不同溶氧水平卜最人生长速率、最人产酶速率、对应时间Table4一      2MaximumgrowthandeellulaseProduetionrate,   timetoreaehthem
最人生长速率(留(L·h));
溶氧(%)
培养时间(h)
最人产酶速率(IU小);培养时间(h)
CMC酶活β-葡萄糖汀酶活
 700.0086切 .000153:320.1妊 0.021:725.92士0.06;72
 500.0078均.000一 24*#;400.23均.01一 *#;807.3肚0.09*#;50
 300.0052切 .000132;480.104士 0.007:884.2肚0.07:88
 0.080士0.014;80
 0.096均 .011*却:84
 0.062士0.008:96
注:*,与高溶氧条件(70%)相比,P>0.05;#,与低溶氧条件(30%)相比,P>0.05。
图4-7不同溶氧发酵12Oh最终酶活力
注:*,与高溶氛条件(7眯)相比,最终酶活力有显著性差异,P>0.05:#,与低溶氛条件(3。%)相比,最终酶活力有显著性差异,P>0.05。
随着溶氧水平的降低,菌体生长高峰延迟,说明溶氧水平增大可以提高菌体生长速率,缩短延迟期。但是过高的溶氧水平造成生长高峰之后的生长速率快速下降,在溶氧(DO)为70%的发酵条件下,发酵到32h之后菌体自溶速度超过生长速度,而溶氧为50%时发酵到48h左右出现菌丝自溶的情况,DO为30%时则推迟到64h,说明高溶氧使菌体自溶速率大大加快,这不利于以菌体为催化剂的产酶过程。在低的溶氧水平(30%)下发酵不仅生长速率低,而且产酶速率比高溶氧条件下低一倍左右,本实验为高溶氧条件(70%)下的56%。说明低溶氧条件抑制产酶的进行。把高溶氧水平70%与中等溶氧水平50%的发酵结果对比,前者可能是由于高溶氧下刺激初级代谢,使得初级代谢旺盛,作为次级代谢的产酶过程就有所减弱,造成最大产酶速率降低;同时也由于初级代谢旺盛,加快了菌体自溶,无法保持高的细胞浓度即催化剂浓度,而且缩短了细胞的生命周期,使产酶的时间缩短,导致最终酶活力不高。从前面的讨论分析可以看出,溶氧对菌体生长及产酶过程有双重影响。在细胞生长培养阶段前期较高的溶氧水平(70%)刺激菌体生长,以提高菌体生长速率,在菌体的对数生长期后期降低溶氧水平到50%左右,既能保持合适的菌体浓度又可避免发酵后期的菌体自溶,同时可以保持较高的产酶速率。

2.4分段溶氧分批发酵对YT02产纤维素酶的影响结果

根据以上试验结果分析,为缩短细胞培养时间及延长产酶过程,提高菌体浓度以提高产酶速率和纤维素酶活力,确定YT02分批发酵生产纤维素酶的发酵条件为发酵0~32h时发酵温度32℃,溶氧70%;32h至12Oh发酵结果发酵温度29℃,溶氧50%,发酵液初始pH值6.0,结果见图4-8。
由图4-8可以看出:在28h达到最大生长速率(核酸0.0118g/(L·h)),在70h达到最大产酶速率滤纸酶 (0.28IU/h)、 CMCase(7.82IU/h),在80h达到最大产酶速率β-葡萄糖苷酶 (0.102IU/h)。高产酶速率时间得以延长,发酵周期缩短,在100h酶活力就达到了最高,FPA、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活均值分别为  11.13IU/mL、465.24IU/mL和4.08IU/mL,与恒定溶氧发酵生产纤维素酶有显著性差异(p<0.05)。  
图4-8条件优化后的YT02分批发酵进程

3结论与讨论

发酵培养过程的温度模式有三种:恒温、分段变温发酵和周期变温发酵。一般来讲,对于丝状真菌发酵生产纤维素酶,细胞生长和产物合成的最适培养条件是不相同的。YT02的发酵过程也证明了这一点。本实验研究结果表明,温度对纤维素酶分批发酵有明显影响。在生长阶段应将温度控制在细胞生长的最适温度范围内,而在产酶阶段则需控制在产酶的最适温度!’841。在SL发酵罐中,32℃适合YT02早期的生长,当置于29℃培养的时候酶活力最大。根据以上实验结果的提示,如果在培养的早期采用相对高的温度,可能会有利于生物量的积累从而间接的提高酶活力。在中后期,适当降低温度,能够保持细胞以一定速度继续生长并且保持和促进纤维素酶的合成和分泌。因此YT02分批发酵宜采取分段变温策略,在分批发酵培养前期30h采用较高的发酵温度32℃,30h后到发酵结束采用29℃发酵以利于生物量积累和细胞产酶。
耗氧发酵中氧的消耗可以分成菌体生长、基础代谢维持和产物合成三部分,氧平衡式可表示为:
-dCO2/dt=mO2Cx+γo/x×dCx/dt+γO/P×dCP/dt--------------(l)
CO2为溶氧浓度(g/l);t为发酵时间(h);mO2为菌体氧维持常数;Cx为菌体浓度(g/l);γo/x为菌体生长耗氧系数; γo/P为产物合成耗氧系数;Cp为产物浓度(g/L)。若产物的合成与氧无关,则γo/p=0。其中dCx/di和dCP/dt可以用实验中菌体浓度和产物浓度的时间变化率的实验值进行三次多项式拟合得到回归式。
在罐型和罐压以及培养基配方确定后,可以大致认为发酵罐的供氧能力仅与通气量和搅拌速率有关,因些当发酵中溶氧水平一定时,可以用通气量和搅拌速率的变化间接地表示菌体摄氧率的变化,即通气量或搅拌速度的提高或降低可以相对表明菌体摄氧率的提高或降低。
从第二章摇瓶转速和装液量对YT02产纤维素酶影响的结果来看,发酵液的溶解氧水平对YT02发酵产纤维素酶有较为显著的影响。在有氧发酵过程中,保证足量的溶解氧强度是发酵控制的主要因素之一。由于反应器中的氧传质限制和氧本身的物化性质常常造成发酵过程中的氧缺乏。氧限制对发酵的影响可分为两种:一种是溶氧浓度直接影响与呼吸链有关的代谢,从而影响产物的合成;另一种是氧直接参与产物的合成,为保证发酵液,有足量的溶解氧,根据气液传递速率方程:OTR=KLa(C*-CL),凡影响推动力C*-CL、比表面积a和传递系数KL的因素都会影响氧传递速率。气-液比表面积的大小取决于截留在液体中的气体体积及气泡的大小。通气量和搅拌都影响比表面积,一方面搅拌作用使气泡在液体中产生复杂的运动,延长停留时间,增大气体的截留率,同时搅拌的剪切作用又使气泡破碎,减小气泡直径。搅拌也影响KLa,增大搅拌功率对KLa的影响较增大通气量更为明显。在通气搅拌操作中,并非通气量越大,KLa就一定越大,通气量的影响有一定的限度,如果超过这一限度,搅拌器就不能将气泡分散到液体中,出现过载现象,这时搅拌效果会大大下降,KLa也不能提高。因此,确定合适的通气量和搅拌速率对发酵非常重要。
无菌空气为三次能源,其成本远高于二次能源电能。本研究在考察溶氧对YT02产纤维素酶的影响时将通气量固定在 0.5vvm,即能降低无菌空气成本,又能使气流速度不会过大,防止使发酵液泡沫增多,发酵罐的有效利用率减小。本研究结果发现溶氧70%能大大促进YT02细胞生长,而DO为50%时在满足产酶需要的同时有效防止了菌体的自溶和早衰。
基于此本工作提出了分段控制策略,即:O一32h时溶氧70%;32h至120h发酵结果发酵溶氧50%,结合温度控制策略:培养前期30h采用较高的发酵温度32℃,30h后到发酵结束采用29℃发酵,发酵液初始pH值 6.0,结果在100h酶活力就达到了最高,FPA、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活均值分别为 11.13IU/mL、465.24IU/mL和4.08IU/mL。分别比摇瓶发酵过程高出了约25%、30%和16%。在提高酶活力的情况下,发酵周期提前约20h。
发酵周期明显缩短,有利于提高设备的利用率和降低纤维素酶的生产成本。这些研究结果为纤维素酶的工业化扩大生产奠定了基础。通过对分批发酵过程pH变化规律发现,初始pH6.O最适合YT02生长;pH5.0最适合该YT02生产纤维素酶,这可能与YT02纤维素酶在pHS.0时最为稳定有关。发酵过程中pH值的变化规律也为发酵的过程控制提供了基础数据。
 

第五章YT02产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究

同前面章节的试验可知:YT02是纤维素酶生长的优良菌株,易培养、生长迅速且能利用农业废料水稻秸秆高产纤维素酶,而且所产纤维素酶对水稻秸秆的降解能力强,高于目前纤维素商品化酶。因此,分离纯化这些纤维素酶并进行性质研究对于了解其生理功能和进一步合理地应用非常必要。
由于自然界中纤维素结构的异质性,微生物为适应各种不同底物的特性需要分泌多种纤维素酶。采用离子交换层析法、凝胶过滤法、HPLC及FPLC法己经从多种微生物中分离纯化得到纤维素酶,并进行了酶学性质和一些生物学功能研究,其中主要集中在酶分子量、等电点、催化反应动力学常数Km值、最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、PH稳定性、底物特异性等方面,其中真菌来源的纤维素酶是研究的重点,真菌纤维素酶之间在分子量、等电点、以及其它理化、生化性质上常表现出一定的差异。真菌胞外纤维素酶系通常有十几到几十个纤维素酶组分,各种不同菌株来源的纤维素酶活性及特性也都不完全相同。本研究采用硫酸铵盐析、透析和Sephadex-G-75分子筛层析从YTO2菌株的发酵液中分离纯化得到了电泳纯的纤维素酶,并对其进行了N端测序、分子量测定和质谱分析,这对于更好的分析了解YT02·纤维素酶高效降解纤维素的分子机制十分重要。YT02纤维素酶的分离纯化,为开发新的纤维素酶和克隆新的纤维素酶基因奠定基础,具有重要的理论意义和实际应用潜力。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料
菌种为本实验室从高黎贡山分离得到的高产纤维素酶的青霉菌突变株YT02。
1.1.2主要试剂
DEAE-SePphadex A-25、Sephadex G-75:均为瑞典pharmacia公司产品;
三羟甲基氨基甲烷   (Tria Base):Promega H5135进口分装;
蛋白质marker:Transgene生物技术有限公司;
蛋白质浓度测定所用的标准蛋白-牛血清白蛋白:购自R℃he公司;;丙烯酸胺 (Aerylamide  Acrylic  aeid amide):Novon公司产品;
甲叉双丙烯酰胺(N,N’-MneBisacrylamide):Amreseo公司产品;
硝酸银(silve:nitrate):北京精细化学品有限责任公司产品;
过硫酸铵 (AmmoniumPersulfate):Sigma公司产品;
考马斯亮蓝G-250(CoomassieBrilliantBlueG250):Amreseo分装;
二硫代苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT):购自Merek公司:
四甲基乙二胺(N.N.N.N-tetramethylenediamine,TEMED):Amreseo分装;
甘氨酸(Glycine):上海生物工程有限公司产品;
十二烷基硫酸钠(SDS):Sigma公司产品。
1.1.3常用储备液及缓冲液
30%丙烯酞胺/亚甲双丙烯酞胺溶液:丙烯酸胺30g,亚甲双丙烯酞胺0.8g,加双蒸水至 100mL,0.45μm滤器过滤,4℃避光保存。
4xTris·CI/SDS(pH8.8):溶解91gTris碱于300mL水中(终浓度为l.5mol/L)。用l  mol/LHCI调节至 pH8.8,加水至 500mL。0.45μm滤器过滤,再加入ZgSDS(终浓度为0.4%),40C保存。
4xTris· CI/sDs(pH6.8):溶解  6.059Tris碱于 40mL水中(终浓度为 0.5mol/L)。用 1mol/L HCI调节至pH6.8,加水至1O0mL。0.45μm滤器过滤,再加入0.49SDS(终浓度为0.4%),4℃保存。
10%过硫酸铵溶液:过硫酸铵59g,定容至 50mL,临用前现配,4℃保存。
5×SDS电泳缓冲液  :Trisbase15.1g,甘氨酸72.0g, SDS5g,加双蒸水至l000mL,4℃保存。
6xSDS样品缓冲液 :7mL4xTris·CI/SDS(pH6.8),3.0mL甘油,lgSDS,0.93gDTT,
1.2g澳酚蓝,加水至10mL,0.5mL分装,保存于-70℃。
水饱和异丁醇:异丁醇和水以1:1混和,上层为水饱和异丁醇。
银染甲醛固定液 :400mL甲醇, 0.5mL37%(V/V)甲醛,加水至1L,室温保存。
0.02%硫代硫酸钠定影液:硫代硫酸钠0.049,双蒸水 200mL,临用前配制。
0.1%(m/v)硝酸银染色液:硝酸银0.59,双蒸水定容至 500mL,临用前配制。
硫代硫酸盐显影液:碳酸钠15g,37%(V/V)甲醛0.5mL,1%硫代硫酸钠 0.2mL。
双蒸水定容至 500mL,每次新鲜配制。
银染停止液:甲醇 250mL,冰醋酸 60mL,加水至 500mL。
1.1.4主要仪器
岛津紫外-可见分光光度计(UV-2450),DYY-III-8B稳压稳流型电泳仪,DYCZ-24A型垂直板电泳槽,  LKB 2235 uvieordRSIIOLKB 2070 ultroRaeR-IIO  LKB 2132 Mieroperpexpump, LKB 2210 potentiometric Recorder,TH-500梯度混合器,YC-l层析实验冷柜,层析柱,HERMLE高速冷冻离心机,TGL-16G台式高速离心机,SL-N高精度电子天平,透析带,JB-2恒温磁力搅拌器。

1.2方法

1.2.1 蛋白质浓度的测定方法
1.2.1.1 标准曲线的绘制
取7支试管,分别加入 0.1mL、 0.2mL、 0.3mL、 0.4mL、 0.5mL、 0.6mL、 0.7mL、0.8mLBSA蛋白质标准溶液 (l.5mg/mL),用超纯水补充到 2mL。再取8支试管,0号管加入 0.1mL蒸馏水,1~7号管依次加入 0.1mL上述7支试管中的标准蛋白质稀释液,然后加入 5mL蛋白质染色剂,充分震荡摇匀,室温温育 10min后于595nm波长下测定光吸收值。以蛋白质浓度为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线如图5-1。
图5-1蛋白质含量标准曲线
1.2.1.2蛋白质浓度测定
粗酶提取液的蛋白含量测定按考马斯亮蓝比色法进行(Braford法),以标准牛血清白蛋白为标准曲线。具体方法如下:将样品适当稀释至蛋白质浓度约为0.1~ 0.8mg/mL,取稀释后的样品 0.1mL,然后加入 5mL考马斯亮蓝G-250蛋白质染色液,充分震荡混匀,室温温育 10min后在可见光分光光度计上595nm波长测定光吸收值,随后按照标准曲线计算蛋白质含量。
柱层析过程,各收集管的蛋白质浓度在紫外分光光度计上测定A280处光的吸收值。
 1.2.2纤维素酶的分离纯化
1.2.2.1发酵生产纤维素酶
SL发酵罐发酵产酶:按第四章优化后条件发酵96h。
1.2.2.2硫酸铵初步盐析
收集发酵液以4℃, 8000r/min  10min离心去菌体,滤纸过滤,取10个  10mL的离心管,每个离心管中加入5mL过滤后的发酵液,分别缓缓加入磨成粉状的硫酸铵0.5g、1g、 1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g和5g,即10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%(m/v)的硫酸铵溶液。轻轻振摇加速溶解。盐析液在4℃下静置过夜;再以4℃, 6000r/min离心 5min,分别收集上清液。测定其酶活性,确定最佳盐析的条件。结果如图5-2。
图5-2不同浓度硫酸铵盐析
Fig.5一ZE山以mesfi妞    etionatedwithdifferentconcentrationofsolid别 rnrnoniumsulfate
从图5-2可知,硫酸铵浓度大于70%时,硫酸铵在发酵液中达到饱和,并有少量的硫酸铵沉淀析出。硫酸铵浓度在80~100%可见明显的硫酸铵固体析出。取上清液进行酶活测定,结果如表5-l。
从表5-1可以看出,不同硫酸铵浓度对纤维素酶的沉淀析出影响显著(P>0.05),当硫酸铵浓度小于30%时,大部分的酶没有析出,上图中的沉淀可能为杂蛋白,应当通过盐析除去。而当硫酸铵浓度达到60%时,纤维素酶各组分几乎全部析出,盐析后的发酵液各项目的酶活性很低,接近于0。硫酸铵浓度在30%~60%之间时,粗酶液内切酶活和β-葡萄糖苷酶活回收率分别为76.65%和77.59%。因此综合考虑酶的得率和酶活情况,确定收集硫酸铵盐析浓度在30%至60%之间的沉淀。表5-1不同浓度(NH4)2S04盐析后纤维素酶活
Tables一          1Cellulaseaetivitybythefractionationwithdifferenreoncentrationof(NH4)250;
(NH4):504盐析浓度(%)内切酶活(IU/mL)β-葡萄糖苷酶活(IU/mL)
 0123.21士 9.9970.87士0.015
 10121.33土 8.6730.85士0.011
 20107.42土 2.3390.75士0.009
 30105.26士 3.6460.71士0.010
  40104.32士 5.2110.62士0.003
 5083.66士 2.3930.41士0.001
  6010.82士 1.0720.26士0.002
 700.63士 0.0110.11士0.001
 800.05士0.0007肚0.00
90肚0.000士0.00
100肚0.000士0.00
1.2.2.4透析去除硫酸铵
透析袋的处理方法:新购买的透析袋,剪成适当长度(大约25cm),按以下方法处理。将透析袋置于50%的乙醇中,50℃处理lh,在1L的烧杯中混合   400mL 10mmol/L EDTA (pH8.0)和400mL 0.05mol/L碳酸氢钠,将50%的乙醇处理过的透析袋移入烧杯中,磁力搅拌 10min,重复二次,双蒸水充分洗涤,4℃ 20%的乙醇溶液保存备用。
透析的方法:将处理好的透析袋转入Tris-HCI缓冲液 (pH8.0)中平衡 30min后,取一定量的粗酶液装至透析袋的1/3处,采用棉线双结法扎好袋后,将袋完全浸没于Tris-HCI缓冲液 (pH8.0)中,4℃冰箱透析约12~18h,其间每隔3~4h,更换一次Tris-HCl缓冲液 (pH8.0),透析后期滴加BaCl2饱和溶液至透析后的缓冲溶液中,检查是否有白色沉淀出现,若无,表明透析已经完全。透析不仅将硫酸铵盐除去,同时把大量色素及小分子物质透析掉,故透析在纯化中起着重要作用。透析后的酶液采用聚乙二醇(:20000)包埋法浓缩至适当浓度用于离子交换柱纯化。
 1.2.2.5 DEAE-sephadex A-25阴离子交换层析
DEAE -sephadex A-25层析参数的确定:
(l)PH值的确定
在离子交换层析中,蛋白依其与离子交换剂亲和力的不同,而以不同程度被吸附于离子交换剂上。离子交换层析平衡(吸附)缓冲液的pH对层析介质吸附酶蛋白的强弱起着决定性作用。故吸附缓冲液的pH值是层析探讨的重要参数。吸附缓冲液pH值一般是先用一种简单的试管实验(Test一 tubeexperiment)来确定。
具体做法如下:用8只装试管,每管装 2mLDEAE-sephadexA-25树脂,分别用不同pH值的缓冲溶液平衡离子交换树脂。缓冲液见表5-2。
表5-2不同缓冲液浓度和pH值
Tables一      2ConeentrationandPHvalueofdifferentbuffer
管号浓度(mmol/L)缓冲试剂pH值
 120呱嗦5.0
哎OJ叹J了6呱嗓
呱嗦
,‘气、︶
Bis一Tris丙烷
Bis一Tris丙烷
八U工口JOn︶O八WH
Tris- HCl
Tris- HCl
Tris- HCl
nU八U︵日甘0︸  nnUnU勺‘,‘,‘,‘,︸,一﹃乙
于装有树脂样品和不同缓冲液的试管中,分别加入100μL酶液样品,各管在4℃下孵育30~ 60min,每隔 5min轻轻摇动试管,孵育结束后,离心机离心,沉淀树脂,取出上清液,以测定滤纸酶活的方法测定其在54Onm处的吸光度,结果见表5-3。
表5-3所测各管的0D540
几bles一 3OD,  0ofeverytube
pH值       5.56.06.57.07.58.08.5
      ODs4o0.3670.3480.2970.2050.1650.0900
根据表5-3数据得出 pH7.0时上清液中酶活性开始消失,表明该pH值时酶蛋白开始与树脂结合。 pH8.0时上清液中酶活性大部分消失,  pH8.5时上清液中酶活性完全消失,表明该pH值时目的蛋白己完全与树脂结合。因此选择 pH8.5作为层析柱的平衡缓冲液的pH值, pH8.0作为层析柱的洗脱缓冲液的pH值。
(2)洗脱离子强度的确定
洗脱初始离子强度也应由试管实验确定。按预先确定的条件选定缓冲液和pH值,取10只试管,分别加入Tris- HCI(pH5.5)的缓冲液10mL、1mL以Tris- HCI(pH8.5)的缓冲液平衡好的DEAE-sepahdexA-25离子交换树脂及 0.1mL的酶液样品,4℃下过夜, 6000r/m离心  10min,弃去上清液,每管中分别加入NaCI溶液(盐浓度从0.1~1.0mol/mL,间隔 0.1mol/mL,以Tris- HCI(pH8.0)的缓冲液配制 )5mL。4℃下处理 60min,离心取上清液,以测定滤纸酶活的方法测定其在540nm处的吸光度。结果如表5-4所示。
表5-4所测各管的OD5400
Tables一   4ODs4oofeverytube
NaCI浓度(mol/L       )0.10.20.30.40.50.60.70.8
        ODs4o0.0240.1610.2320.2540.2860.3030.3020.310
根据上表数据得出盐浓度为 0.2mol/L时上清液中出现酶活性,表明在该盐浓度下酶蛋白开始被洗脱,因此 0.2mol/L的盐浓度作为洗脱的初始盐浓度。同时看到在盐浓度达到 0.6mol/L之后,洗脱的酶蛋白活性变化很小,表示在该盐浓度时,酶蛋白已全部被洗脱下来,因此采用 0.2mol/L~ 0.6mol/L的NaCI对DEAE-sePhadexA-25阴离子交换层析柱进行吸附酶蛋白的洗脱。
(3)DEAE-sepahdexA-25离子交换层析柱的制备
根据 DEAEsepahdexA-25的特性和以上试管试验计算出所需凝胶干粉的量,浸泡在足量的蒸馏水中,水浴煮沸溶胀3h,室温下过夜自然溶胀,轻轻倾去上层蒸馏水,再用 0.5mol/L的HCI浸泡3Omin。其间玻璃棒轻轻搅拌,使凝胶带上反离子Cl-。再用大量蒸馏水洗至接近中性,并倾去上部不沉降的细小颗粒。继续用大量平衡缓冲液Tris-HCI  (0.02mol/L,pH8.5)充分浸泡,一直平衡到 pH8.5为止。最后用超声波脱气,湿法装柱,层析柱规格为  2.5cm×l00cm。柱充分清洗后,再用 0.02mol/L pHS.5的Tris-HCI缓冲液清洗,层析柱内先装20~30mL的缓冲溶液,湿的凝胶与少量平衡缓冲液混合均匀,一次性倒入垂直的柱中,自然沉降,凝胶面上始终有 2cm以上的缓冲液覆盖。用5倍柱床体积的Tris- HCI(0.02mol/L, pH5.5)平衡缓冲液洗涤柱子,流速为  5mL/min,使凝胶柱充分沉降,并检查柱子是否漏液。取 20mL浓缩后的酶液上样,然后仍采用 0.02mol/L pH8.5的Tris-HCI缓冲液充分洗脱,用紫外分光光度计监测洗脱液A28。值,直到洗脱至洗脱液A280值小于0.005。吸附的蛋白质用Tris- HCl(0.02mol/L, pH8.0)缓冲液配置的NaCl溶液梯度洗脱。NaCl浓度为0.1~ 0.8mol/L,共 1000mL,采用连续线性洗脱。流速为 30mL/h,每收集管 5.0mL, 10min收集一次。自动部分收集器收集,共收集150管。测定各管A280紫外吸光度值和酶活性。合并具有活性峰各管中的酶液,并检测管中酶液的蛋白含量及纤维素酶活力。
1.2.2.5sephadexo-75分子筛凝胶过滤层析
sePhadexG-75凝胶过滤层析柱的制备:根据sepahdexG-75的特性计算所需凝胶干粉的量,浸泡在足量的蒸馏水中,水浴煮沸溶胀3h,室温下过夜自然溶胀,继续用大量平衡缓冲液Tris- HCl(0.05mol/L, pH8.5)充分浸泡,一直平衡到 pH8.5为止,洗的过程,玻璃棒轻轻搅拌,小心倾去上层不沉降的细小颗粒。最后用超声波脱气,湿法装柱。收集经过离子交换柱的酶液用聚乙二醇20000浓缩至 4mL,上样至预先用 0.05mol/L的Tris- HCl (pH8.5)缓冲液平衡过的sephadexG-75(柱规格:2.5cm×40cm)柱,洗脱并分部收集,流速为 18mL/h,每管收集 5mL,自动部分收集器收集,10min收集一次,分别检测各管A28。紫外吸光度值和酶活性。
 1.2.3纤维素酶SDS-PAGE凝胶电泳纯化及酶相对分子量的测定
 1.2.3.1 SDS-PAGE电泳方法
(l)采用 DYY111型垂直板电泳槽(北京六一仪器厂生产,板面积      115mm×135mm)。按厂商说明书,用2块干净的玻璃板和2个 0.75mm的隔条,组装电泳装置的玻璃平板夹层,并将其固定在灌胶的支架上。
(2)10%分离胶溶液配制:在6.25mL Milli-Q纯水中依次加入  3.75mL 4×Tris·CI/SDS (pH8.8)缓冲液、 5mL 30%丙烯酞胺/0.8%甲叉双丙烯酞胺混合液、50μL10%(m/V)过硫酸铵及10μ LTEMED。
 (3)3.9%积层胶溶液配制:在一个 25mL带侧支的三角瓶中,混匀 0.65mL30%丙烯酞胺/0.8%甲叉双丙烯酞胺混合液、   1.25mL 4×Tris·CI/SDS(pH8.8)缓冲液和3.05mLMilli-Q纯水,真空脱气5~ 10min.加入25μL10%(m/V)过硫酸铵及5μL TEMED。轻轻旋转混匀,立即使用。
(4)用 5mL的移液枪将分离胶溶液沿着一个隔条的边缘加到玻璃板夹层中,直到玻璃板之间溶液高度约为 11cm。用 1mL的移液枪先从一侧隔条边缘,再从另一侧隔条的边缘缓慢地往凝胶的顶部加入一层水饱和的异丁醇(厚约 1cm),让凝胶在室温下聚合30~60min。聚合后倒去异丁醇,用 1×Tris·CI/SDS(pH8.8)缓冲液彻底冲洗。
(5)用 1mL的移液枪将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条边缘加入到玻璃平板夹层中,直到夹层中的溶液高度离玻璃板顶部约1cm高为止。小心不要产生气泡。插入 0.75mm厚的塑料梳子,再补加积层胶溶液填满梳子间的空隙,让积层胶在室温聚合30~ 45min。小心拔出梳子,以1×SDS电泳缓冲液冲洗加样孔,并充满加样孔。
(6)根据厂商说明书,将灌好的凝胶夹层固定至上层缓冲槽上,在下层缓冲液槽中加入1×SDS电泳缓冲液,然后将凝胶夹层放入下层缓冲液槽中,往上层缓冲液槽中加入部分1×SDS电泳缓冲液至覆盖凝胶加样孔为止。
(7)在密封的微量离心管中,用6×SDS样品缓冲液按1:1(V/V)的比例稀释酶液样品,于100℃煮沸3~ 5min。用20μL的移液枪将样品小心地加入凝胶加样孔。使样品在孔的底部成一薄层,加样量为18μL,在对照孔中加入分子质量标准品,空置的加样孔,加入等体积的1×SDS样品缓冲液。
(8)再往上层槽中加入1×SDS电泳缓冲液,完全覆盖上层槽的铂电极。将整个电泳装置置于4℃的冰柜中,连接电源,先在 10mA恒流下电泳,直到浪酚蓝指示剂进入了分离胶,将电流增至15mA,继续电泳,直到嗅酚蓝到达分离胶底部为至。
(9)关闭电源,弃去电极缓冲液,取出凝胶夹层板,撬开一块玻璃板,露出凝胶,小心地从另一块玻璃板上取下凝胶,在凝胶的一角切去一个小三角,以便在染色和凝胶干燥后仍能认出加样顺序。
 1.2.3.2SDS-PAGE胶快速银染
(l)将凝胶置于含有3倍凝胶体积甲醛固定液的塑料方形容器中,在脱色摇床上摇动 15min。
(2)倒出固定液,加入5~10倍凝胶体积的水,摇动 5min.重复2次。
(3)将水弃去,加入3倍凝胶体积的0.02%硫代硫酸钠,摇动 1min。倒出硫代硫酸钠,加入5~10倍凝胶体积的水,摇动 1min。重复2次。
(4)将水倒掉,加入3倍凝胶体积的0.1%硝酸银,摇动 10min.除去硝酸银,加入5~10倍凝胶体积的水,摇动 1min。重复2次。
(5)将水倒掉,加入3倍凝胶体积的硫代硫酸盐显影液,直到棕色沉淀形成,弃去显影液,再加3倍凝胶体积的硫代硫酸盐显影液,刚好在条带达到合适强度之前,迅速用水洗涤凝胶,以除去过量的硫代硫酸(避免背景染色)。
(6)加入50%甲醇/12%乙酸,摇 10min,终止反应。将凝胶扫描照相后置于可重复密封的塑料袋中,4℃保存。
 1.2.3.3 YTO2纤维素酶相对分子量的测定
以标准蛋白质相对分子量的对数(lgMr)为纵坐标,相对迁移距离(相对迁移距离=蛋白质分子迁移距离c而染料迁移距离cm)为横坐标作图,得到标准曲线,如图5一-3。
图5-3 SDS-PAGE电泳确定相对分子量
根据YTO2纤维素酶分子的相对迁移距离,根据标准曲线计算其相对分子质量(迁移距离是指从加样孔底部到条带中心的距离)。
1.2.4酶蛋白的N端测序
1.2.4.1聚丙烯酞胺凝胶电印迹到PVDF膜
该方法使用Bi小Rad公司的固相板槽转移装置,电极板之间有 7cm的空隙。
(l)高纯水充分冲洗电转仪,用卜转移缓冲液充满转移槽,将凝胶盒支架、纤维垫和湿润的聚乙烯片浸入转移缓冲液中。
(2)用刀片从聚丙烯酞胺胶上除去积层胶,弃掉,在分离胶的左下角切去一小块,以便在后续的步骤中标记泳道的方向。
(3)在含有约 250mL l×转移缓冲液的玻璃皿中平衡凝胶 5min。剪一张比凝胶大0.5~1cm的PVDF转移膜。使用高截留的Trons-Blot膜用于蛋白质测序;使用低截留的Immobilon-p膜用于染色。
(4)剪一张比PVDF膜大约 0.5cm的Whatman l号滤纸,将PVDF膜在含有100%甲醇的干净玻璃皿中湿润5s,将膜转移至含有转移缓冲液的托盘中,任何时候都切勿使膜干燥,否则将阻碍蛋白质的转移。
(5)将打开的凝胶支架盒置于干净、平坦的表面上,在其上面放置一个湿润的纤维垫,接着放上凝胶支持片。将凝胶面向下放在支持片上,在凝胶上加5~ 10mL转移缓冲液。
(6)将浸湿的PVDF膜的两面轻轻滑过玻璃托盘的边缘,以除去气泡,重新将膜浸入转移缓冲液中数秒,然后将膜在凝胶上方对准凝胶,使膜的中央接触凝胶,从中心向外慢慢地放下膜,将所有气泡赶到凝胶的边缘。用高纯水冲洗戴手套的手,轻轻地将膜抚平,确保均匀地接触凝胶。
(7)用转移缓冲液短暂地湿润的滤纸,覆盖在PVDF膜上,轻轻地抚平以除去所有气泡。在滤纸上放置另一张纤维垫,关上转移盒。确保转移夹层均合适紧贴,以使凝胶和膜接触良好。
(8)将安装好的转移盒放入转印槽中,凝胶朝向阴极,膜朝向阳极。在转印槽中充满1×转移缓冲液,缓冲液完全覆盖电极板,但又不接触电源接头。连接电源,在 200mA恒流下转移2h。
(9)关闭电源,去掉连线,打开转移夹层,取出膜和凝胶,用高纯水彻底冲洗膜3次,每次 5min。凝胶用银染色,以评定转移效率;将膜用于蛋白质测序和质谱分析。
1.2.4.2考马斯亮蓝R250检测PVDF膜的蛋白质
(l)将电转后的PVDF膜迅速放入塑料容器中,并加入考马斯亮蓝染色液浸没膜,室温下染色5~ 10min。
(2)弃去染色液,加入脱色液浸没膜,在PVDF膜完全脱色后换液。共换3~4次脱色液,脱色30~ 60min。
(3)用水洗PVDF膜约5~ 10min。
(4)重复洗膜5次。
1.2.4.3纤维素酶N端序列的测定
采用ABI公司的492型 ProoisecLC蛋白测序仪,该仪器可在50~ 100pmol水平上比较顺利地测定20~30个氨基酸,在加ol级水平上也可测定5~10个氨基酸,测定方法采用Edman降解法,蛋白质的自由a-氨基与PITC(异硫氰酸苯脂)偶联后,与之相邻的第二残基的肤键大为削弱,在无水酸TFA(三氟乙酸)的作用下发生特异性的断裂,暴露出第二个残基的α-氨基,再PITC反应,循环往复地进行偶联降解反应。再应用细径(内径 0.8mm,流速40μL/min)的HPLC柱对PTH氨基酸进行分离,可测定浓度低至finol的蛋白。
将用考马斯亮蓝R250浸染过含有目的蛋白的PVDF膜在空气中晾干,切下目的蛋白带,剪成直径小于6nun的小片,置于  ABIProteomicsSysteml专用于PvDF膜测序的特制反应室,全自动操作。
1.2.5酶蛋白的质谱分析
仪器采用ABI的 ProteomiesSysteml,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(M而x一  AssistedLaserneso印  tionIonizationTime一or-night,MALnl一TOF)。将待测样品与能够吸收特殊波长的光的小分子基质(Matrix)混合,可形成相应的结晶。基质在高压激86光的作用下吸收光子而激发电子,释放能量转移到样品上,使样品离开基质表面进入飞行管中,根据质荷比(而z)的不同来达到检测的目的。
利用肤质量指纹技术  (peptidemassfinge印rinting,pMF),将在PAGE胶上分离的蛋白用胰蛋白酶进行特异性酶解,所产生的肤段的精确分子量通过质谱(MALDI一TOF一MS)来测量,得到的所有肤质量最后通过ABI的 Protcomiessysteml自带的软件AutoMs一Flt或在线与数据库中理论肤质量相比对。在最短时间内进行高通量的蛋白质鉴定。

2结果与分析

2.1DEAE一SePhadexΑ-25阴离子交换层析结果

2.1.1层析收集管酶蛋白同洗脱缓冲液NaCI浓度的关系
经过硫酸铵分段盐析提取、浓缩得纤维素酶粗蛋白,经透析脱盆、PEG(加000)浓缩后,上样DEAE一SePhadexΑ-25弱阴离子交换柱,以含NaCI的Tris- HCl缓冲液洗脱。以洗脱的收集管数为横坐标,以蛋白质UV检测A28。值为左纵坐标,右纵坐标为洗脱的NaCI浓度,洗脱曲线如图5-4所示。
图5- 4DEAE-SephadexΑ-25阴离子交换层析纤维素酶蛋白洗脱曲线
为了确认含酶的收集管的位置,对全部收集管做酶活检测。在NaCI浓度为 0.2mol/L至 0.45mol/L时洗脱出多个很小的蛋白峰。对其对应的接收管进行酶活测定,没有检测到相关纤维素酶活,表明盐析、透析后的酶液中仍含有大量杂蛋白,但含量不高。在NaCI浓度为 0.5mol/L时洗脱出一个大的蛋白峰,对其对应的接收管进行酶活测定,在洗脱管第50管至第58管和洗脱管第125管至第132管都检测到内切葡聚糖酶活性(CMCase)和p-87葡萄糖苷酶活性(BG),在洗脱管第80管至第85管检测到内切葡聚糖酶活性(CMCase),在NaCI浓度为 0.6mol/L时终止洗脱。
2.1.2层析收集管酶蛋白活性检测
对有酶活性的所有收集管测定酶液的体积、蛋白质含量以及酶的活力。结果显示:总蛋白为 138.94mg,具有CMC酶活的管总酶活 19843IU,t匕活力为 142.81IU/mg;具有p-葡萄糖苷酶活的管总酶活 197.44IU,比活力为 1.42IU/mg。
 2.2SephadexG-75分子筛凝胶过滤层析结果
通过DEAE一sePhadex阴离子交换层析分离,己将部分酶蛋白分离开,但内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶可能由于吸附性能相近而未能完全分开。故仅经过离子交换层析不能将酶蛋白完全分开,通过分子筛凝胶过滤层析则可有效将蛋白分离。
 2.2.1sephadexG-75分子筛凝胶过滤层析分离酶蛋白
合并有酶活性的洗脱管所有酶液,透析、聚乙二醇(20000)浓缩后上分子筛凝胶过滤层析柱。横坐标为收集管号,左纵坐标是个收集管紫外检测A28。的吸光值,绘制洗脱曲线,如图5-5:洗脱曲线显示一个大的,许多个较小的蛋白洗脱峰,通过测定表明大峰没有酶活性,小峰1和3出现CMC酶活性。2号小峰出现BG酶活性。表明酶液经过离子交换层析后还含有杂蛋白,且杂蛋白的量仍较高。故仅经过离子交换层析不能将杂蛋白完全,通过分子筛凝胶过滤层析则可有效将蛋白分离。
图5一 5 sephedexG-75分子筛凝胶过滤层析纤维素酶蛋白洗脱曲线
2.2.2分子筛凝胶过滤层析纤维素酶活测定结果
将分子筛凝胶过滤层析有活性的收集管分别测定酶液蛋白质含量以及酶的活力单位。结果显示:具有CMC酶活的管总蛋白为 12.02mg,总酶活 6851IU,比活力为 569.97IU/mg;具有β-葡萄糖苷酶活的管总蛋白为 7.17mg,总酶活 46.81IU,比活力为 6.52IU/mg。

2.3纤维素酶各纯化步骤纯化情况

对各步骤纯化的纤维素酶测定其蛋白质含量、酶的活性,计算其总酶活、纯化倍数、酶的收率。结果如表5-5、表5-6所示。
表5- 5CMcase纯化步骤及纯化效率
Tables一     5PurifieationstePandeffieieneyofCMCase
总蛋白量
(mg)
总酶活t匕活性
纯化倍数
(IU/mg)
回收率
纯化步骤
(IU)(%)
发酵液
(NH;)250;盐析
DEAE一SePhadexΑ-25
离子交换层析
SephadexG-75凝胶过
滤层析
 6497342.27100
 5095770.6878.43
 19843142.81 3.3730.54
  6851569.9713.4810.54
1537721﹄l2.02
表5-6β-葡萄糖苷酶纯化步骤及纯化效率
Tables一     6PurifieationstePandeffieieneyofβ-glueosidase
总酶活回收率
纯化步骤
总蛋白量
(mg)(IU)
比活性
纯化倍数
(IU/mg)(%)
发酵液    1537542.730.351100
(N比):504盐析      721450.950.621.7783.09
DEAE一SePhadexΑ-25
    138.94197.441.424.0536.38
离子交换层析
SephadexG-75凝胶过
      7.1746.816.5218.628.62
滤层析
从表5-5和表5-6可知,随着纯化的加深,蛋白量大幅度下降,说明纯化过程中去掉了大部分杂蛋白,也可能包含部分的酶蛋白;总酶活从发酵液到硫酸铵盐析,从硫酸铵盐析到柱层析,总酶活有大幅度的下降;比活性来看,从硫酸铵盐析到柱层析,比活上升幅度非常巨大,故柱层析的分离酶蛋白的效率较高。就纯化倍数看,柱层析也显示出理想的纯化效果。 2.4SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳
 2.4.1SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳银染结果
进行SDS-PAGE凝胶电泳,电泳后凝胶采用采用银染色法,结果如图5一6所示。染色结果显示,原发酵液泳道有拖带,且明显含有大量的不同分子量蛋白,经过盐析、透析后酶液杂蛋白明显减少,但仍然含有多种蛋白。
图5-6不同纯化步骤纤维素酶的SDS-PAGE凝胶电泳硝酸银染色
M:蛋白质标准;1:原发酵液;2:硫酸铵盐析、透析后;3,4:空白对照;经D〔A卜s即hadexΑ-25离子交换层析和sephadex于75凝胶层析后5,6,  8:Endog1ucanase;7:β-g.ucosidase。
        
由图5-6可以看到,经DEAE-sephadexΑ-25离子交换层析后在胶的底部有模糊的几条杂蛋白带,其它杂蛋白已完全去除。再经sephadexG-75凝胶过滤层析后,合并有活性的收集管点样进行电泳,染色后发现基本为单条带稍有拖带现象。将经凝胶过滤后收集的有活性的蛋白峰值所在位置的收集管点样电泳、染色后发现,只显示单一条带,且无拖带现象产生,表明纤维素酶得到进一步纯化。
2.4.2纤维素酶分子量SDS-PAGE凝胶电泳测定结果
SDS-PAGE电泳,测量出各种标准蛋白的迁移距离,求出相应的相对迁移率,根据标准曲线得到β-葡萄糖苷酶的分子量为 57.8kDa。CMCase的二个组分分子量分别为 :73kDa和 43kDa。

2.5酶蛋白的N端测序结果

末端测序是了解蛋白信息的一种常用方法,通过N一端测序可以对某些N一末端氨基酸序列相对保守的蛋白进行一级结构的比对,从而根据相似的已知蛋白的结构来推测目的蛋白的结构和作用机制。对各电泳纯的纤维素酶组分进行N一端测序,测序的方法是Edman降解法,结果只测到了一个内切纤维素酶蛋白的N端序列,见图5-7。
图5一7纤维素酶氨基酸图谱
Blank:空白对照图谱;Standard:标准氮基酸;dptu:反应副产物峰;Residuel,ResidueZ,3,4…代表不同的氮基酸。
图5-7中每一张氨基酸图谱对应一个氨基酸测定的结果,根据出峰的时间(参照标准图)及峰形高低(参照前一个氨基酸残基图谱)进行判断这个峰是哪一个氨基酸。通过分析,该内切纤维素酶的N端前12个氨基酸序列为:SCCFVWFCASEC,其它二个酶蛋白由于N端封闭,未能测出。用BLAST对测定的酶蛋白进行网上比对分析,没有发现与其同源性高的纤维素酶蛋白序列。可能该酶蛋白的N·末端并不是保守的序列,或者N一末端所能提供的信息相对较少,还需对其进行了进一步的分子生物学验证。2.6酶蛋白的质谱分析结果将纯化后的纤维素酶经SDS-PAGE后切胶、去染色剂后,用10n留mL的胰蛋白酶酶解过夜,并抽提酶解后的肤段,进行MALDI一TOF质谱分析。结果见图5-8、图5-9、图5-10。
图5-8内切酶I的质谱分析图
图5-9内切酶n的质谱分析图
图5-10β-葡萄糖苷酶的质谱分析图
将酶蛋白的质谱信息输入到质谱数据库中进行搜索,没有得到相似的纤维素酶序列。

3结论与讨论

蛋白质分离纯化是研究蛋白质化学组成、结构及生物学功能的基础。要从复杂环境中分离出高纯度的蛋白质,同时防止其空间构象的改变和生物学活性的损失,需要各种特殊技术和操作方法。蛋白质提纯基本原理均是以蛋白质的性质为基础,依据蛋白质的理化性质(如溶解度、分子量、带电荷状况等),按照生物大分子的活性进行提取(如亲和层析和免疫法)。常用的纯化方法主要有盐析、凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析、电泳、超离心沉降和免医学方法等。提纯的蛋白质还要进行化学、物理学、生物化学和免医学等方法的鉴定。
本实验中,YT02的发酵液中含有大量杂蛋白,采用分段盐析可以去除大部分杂蛋白,同时可以保持纤维素酶的高活性。在进行柱层析前,需要将过多的困场)250;脱掉。用透析的方法,在保持酶活性的前提下,不仅去除了州氏)2504,同时也去掉了大量的色素,这有利于后面的柱层析。离子交换层析,选用DEAE一sePhadexΑ-25具有若干优点:对蛋白质无害且仅有很低的非特异性吸附,有高的吸附容量、高的流速,它既具有离子交换作用还具有分子筛的作用;具有耐受较广的pH的能力;具有亲水性,对大分子的吸附不是十分牢固,采用温和的洗脱方法既可以将目的酶蛋白洗脱下来,不致引起酶的失活。DEAESephadexΑ-25离子交换层析后,去掉了大量的杂蛋白,但还没有完全纯化,故再次使用sephadexG-75分子筛凝胶过滤层析。酶液基本得到纯化,获得电泳纯的内切葡聚糖酶二个,94分子量分别为 73KDa和 43KDa。在50℃具有最高内切葡聚糖酶活力,不具有外切葡聚搪酶和β-葡萄糖苷酶活力,是一个中温的内切葡聚糖酶;获得电泳纯β-葡萄糖苷酶一个,分子量为 57.8KDa,SDS-PAGE均为单一条带,说明纯化效果明显。
蛋白质在生理条件下较为稳定,但在分离纯化时,由于采用的条件和其赖以生存的生态条件不同(特别是氧化还原势、分子伴侣、稳定因子和膜的失去),再加上纯化条件要比生理条件剧烈,致使蛋白质天然构象遭破坏导致变性失活。这就要求在纯化操作中采取一些必要的措施来保护蛋白质的活性。一般影响其活性的环境因素有温度、pH值、缓冲溶液的组成、蛋白酶以及物理因素等。纯化过程中,为了尽力避免酶的失活,硫酸铵分级盐析在冰浴中进行,透析过程以及离心等均在4℃环境下。因为纤维素酶在较高的pH值下稳定性较好,再考虑到酶的吸附,故层析采用的缓冲液体系均是 pH8.5。最后,通过sDs一队 GE凝胶电泳,银染得到单一条带,纤维素酶得到完整纯化,说明阴离子交换层析后进一步过分子筛凝胶过滤层析是必需的。经过N端测序和质谱分析,没有在数据库中搜索到类似的纤维素酶序列,说明这几种纤维素酶蛋白可能是新的纤维素酶,本研究属首次报道;当然,也可能是目前质谱技术更多的应用于对不同样品中蛋白差异表达的分析,对于未知蛋白的定性研究,效果还不是很理想,能够获得的质谱信息同基因信息相比还相对较少:而且也可能是酶蛋白的保守区域不明显,所以无法得到相似的序列。


 

第六章酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建及其细胞固定化研究

纤维素原料转化燃料乙醇,高活力的纤维素酶是其中的一个关键因素。纤维素酶是一种多组分的复合酶,复合酶协同作用的结果刁‘能将纤维素大分子转化为葡萄糖。纤维二糖酶能水解结合于末端、非还原性的β-D一糖普键,同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基,将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。由于纤维素酶系中纤维二糖酶活相对较低,纤维素酶解的中间产物纤维二糖是纤维素酶的非竞争性抑制物,会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制,纤维二糖的水解成为纤维素酶降解纤维素的限速步骤。
酿酒酵母(5.cerevisia。)是传统的酒精生产菌株,并且具备良好的工业生产现状,耗糖快、乙醇耐受力高、对水解糖液中有毒物质抗性强;并且其全序列己测定,遗传操作技术也己经成熟。搪代谢是酿酒酵母重要的代谢活动,在酒精发酵中,酿酒酵母主要利用的三种糖是葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖,不能利用纤维二糖l’州。因此,利用分子生物学技术改造酿酒酵母工业菌株,赋予酿酒酵母代谢纤维二糖的能力,扩大酿酒酵母的底物利用范围,使其在同时糖化和发酵(SSF)的过程中降解纤维二糖产生葡萄糖,可以完全或部分解除纤维二糖对纤维素酶的抑制作用1200)。
传统的乙醇生产工艺通常采用游离的酵母细胞,以葡萄糖为原料进行发酵,在此过程中,由于菌种的前期生长需要消耗糖分,致使葡萄糖对乙醇的转化率有所下降,发酵周期相对较长。本章对代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌细胞的固定化和固定化细胞的发酵性能进行了研究,以期为生物转化纤维原料生成乙醇的产业化奠定基础。

1材料和方法

1.l材料

1.1.1菌株和质粒
本章使用的菌株和质粒见表6-1,多拷贝整个载体pYMIKP质粒物理图谱见图6-1。
1.1.2分子克隆用酶和试剂
碱性磷酸酶(CIAP)、限制性内切酶、几qDNA聚合酶(上海博亚生物技术公司,BioAsia),几DNA连接酶(几KaRa公司),DNA片段回收与纯化试剂盒 (OmegaBio一tek公司(USA)的  E.Z.N.AGelExtraction试剂盒),酵母粉、胰蛋白胨(OXOID),其它化学试剂均为国产分析纯。
表6 1本研究所使用的菌株和质粒
菌株及质粒遗传性状和特征来源
 EeoliDH5a
F.,  U169,deoR,recAI,en朔I,hsdRI7(rk-
mk+),s即E甲李只一,rhi一z,舒“夕‘,re“z
γo囊复膜抱酵母
NAN-27
PYMIKP
Zn,酒精生产酿酒酵母工业菌株
多拷贝整合质粒,Kan人工Y甲
本实验室保存
本实验室保存
河南天冠企业集团提供
本实验室构建[2021
万加dlll心泛n
万加dlll
.匆五1Ba勿陇Hl
施了I
刀甲 M11
月乖五I大知‘m
 
图6 1 pYMIKP质粒物理图谱
1.1.3水稻秸秆水解液的制备
经1%HCI和1%NaOH预处理的水稻秸秆,自来水充分冲洗后在80℃烘干。取 1009作为纤维素酶解底物,固液比为1:10,加入YT02发酵产生的纤维素酶,使每克底物的酶用量为  15Iu(FPA酶活)。在50℃、 pH5.0条件下水解48h。过滤去除固体残渣,所得的水解液中葡萄糖含量32.590g/L,纤维二糖为3.426g/L。
1.1.4培养基
 1.1.4.1E.eoli用LB培养基
1%蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCI,用NaoH调 pH7.6;固体培养基加 1.5%琼脂粉, 10磅灭菌20分钟。使用时可补加100林g/mL的氨节青霉素(Amp)作为选择培养基用于选择转化子。
 
1.1.4.2酵母菌用YEPD培养基
2%蛋白胨:l%酵母粉,2%葡萄糖;固体培养基加1.5%琼脂粉,8磅30min灭菌。
1.1.4.3YNB基本培养基
YEastNitrogenBase6.59,葡萄糖209,加蒸馏水至1000, pH6.0一6.5,固体培养基加1.5%琼脂粉,8磅30min灭菌。
1.1.4.4转化子挑选培养基(G418抗性)
YeastNitrogenBase6.5g,葡萄糖20g,加蒸馏水至 1000mL, pH6.0~6.5,固体培养基加1.5%琼脂粉,8磅30min灭菌。使用时按所需浓度添加一定量的G418。
1.l.4.5YNBC发酵培养基
酵母氮基(不含氨基酸):6.7g;纤维二糖:20g;亮氨酸:0.12g;色氨酸:0.12g:组氨酸: 0.12g;腺嚓吟 :0.12g;蒸馏水 1000mL。
1.1.4.6 纤维原料水解液发酵培养基I
纤维原料水解液1000mL,酵母粉5g,添加200mg/mL氨节青霉素。
1.1.4.7纤维原料水解液发酵培养基H
纤维原料水解液 1000mL,酵母粉5g,121℃,灭菌 30min。

1.2方法

1.2.1含纤维二糖酶基因(BGLj)的重组质粒pYMIKΒ-BGLI的构建方法
PCR方法得到扣囊复膜抱酵母的纤维二糖酶基因片断BGLI连接到多拷贝整合载体PYMI砂上,连接液转化  E.coliDHsa,得到转化子后,随机挑取一定数量的转化子小量制备质粒,进行sall酶切电泳检测。选取正确连接的质粒,得到重组质粒pYMIKΒ-BGLj。
含目的基因BGLI重组质粒的构建过程如图6-2。
图6-2含目的基因BGL了重组质粒的构建
1.2.2酿酒酵母纤维二糖代谢途径的搭建方法
1.2.2.1菌体的生长
大肠杆菌于37℃平板培养1一2天,液体振荡培养12h;酿酒酵母于30℃平板培养2~3d,液体振荡培养24h。也可根据不同实验要求调整培养时间。
1.2.2.2扣囊复膜饱酵母染色体的提取
取15mL的酵母过夜培养物,离心收集菌体,用 0.5mL的无菌水悬浮, 13000rpm离心305,加200μL的裂解缓冲液(20,0(v/v)Tritonx一100,10,0(v/v)505, 100mmol/LNael,10Inmol/LTris一ClpHS·0,lmmol/LEDTApHS.0)悬浮细胞,再加200μL的玻璃珠和200μL的酚/氯仿,振荡 3min,加200μLTE混匀,13000rpm离心 5min,将上清加 1mL的无水乙醇沉淀,13000甲m离心 10min,干燥后加400μL的TE,5μLlomg/mL的RnaseA,37℃温育 15min,加10μL4M的乙酸按、 1mL无水乙醇混匀后13000甲m离心10min,去上清干燥,用100μL的TE溶出。DNA溶液可通过oD260的读数,计算出其中核酸的浓度,IOD26。相当于50林g/mL双链DNA。从OD26。:onZso的比值可以了解核酸的纯度,纯的DNA制品的0D26。:ODZs。为 1.8一2.0。
2.2.3琼脂糖凝胶电泳检测
参照《分子克隆实验指南》标准方法进行。
l.2.2.4PCR反应获得β-葡萄糖苷酶基因(BGLI)
引物由上海英骏生物有限公司合成,所使用的引物如下。
上游引物 :invitrogenNo:C28347一29632, 3lbp;Tm=56℃;引物位置277一297。   TGCAGGATCCAl,  GTTGAl,    GArAGTACAGCTT。
下游引物 :invitrogenNo:C28347一29633,3lbp;Tm=56℃;引物位置2887一2907。
         TGCAGGATCCTCAAATAGTAAACAGGACAGA。
上下游引物扩增区间扩增区间:277一2907,扩增长度 :263lbP。
PCR反应采用美国生产PERKIN一 ELMERCetus的PCR仪,PCR条件如下:
95℃变性 2min
SCeV甘CUn,J、|,1.95℃变性 20see56℃复性 40sec
72℃延伸 3min
72℃延伸 5min
4℃保温
1.2.2.5琼脂糖凝胶中 BGLIDNA片段的回收与纯化
琼脂糖凝胶中DNA片段的回收与纯化采用 omegaBio一tek公司(usA)的 Ez.N.AGe!Extractinn试剂盒,根据试剂盒说明操作。
1.2.2.6限制性核酸内切酶酶切pYMIKP质粒
pYMIKP质粒用BGLn酶切,BGL了基因用BamHI酶切,DNA的限制性内切酶酶切依据各公司提供的操作手册进行。
1.2.2.7酶切片段的去磷酸化和连接
100适量的DNA样品被限制酶消化后,酚:氯仿抽提灭活内切酶,加入2倍体积的无水乙醇沉淀回收DNA。离心干燥后以90μLddH20溶解,加入10协  L1oxCIP去磷酸化缓冲液,1单位的牛小肠碱性磷酸酶,混匀后37℃保温30min。反应结束后加入终浓度为5mmol/L的 EDTA(pH8.0),75℃加热lomin,电泳后切胶回收。
粘性末端直接在连接系统中进行,外源目的DNA片段和载体DNA的摩尔比一般为2:1或 4:1。连接反应在16℃过夜,琼脂糖凝胶电泳检测连接效果。
1.2.2.8表达BGLI基因的重组菌株的构建
构建方法采用酵母菌完整细胞转化法,将过夜培养的酿酒酵母NAN-27转接至 50mLYEPD中,使菌体浓度OD60。为0.25,30℃振荡培养到一定菌体浓度OD600=O.7一 1.0(经验上接2一 2.5mL菌,约培养4h),将 50mL菌转入无菌离心管,3000甲m, 5min离心,弃YEPD培养基。重悬细胞于 25mL无菌水中,3000甲m, 5min离心。去上清,重悬细胞于 1mL的100mMLIAe中。分成50μL小份离心后,依次加入240μL50%pEo6000,36μLlmol/LLIAc,5μL单链鱼精DNA,70μL无菌重蒸水和多拷贝重组质粒pYMIKβ- BGLIDNA混匀。30℃保温 30min后,42℃水浴中热激 25min。离心除去全:宇青,重悬细胞于无菌水中,涂布相应的选择平板,30℃恒温培养3一4天,筛选转化子120,l。
1.2.2.9转化子细胞β-葡萄糖苷酶活测定方法
4℃、   5000r/minx10min离心收集菌体,用适当体积的柠檬酸缓冲液   (0.05MpH5.0)洗涤菌体,再次离心,重复两到三次。然后用适当体积的柠檬酸缓冲液重悬菌体,冰浴中对菌体进行细胞破碎,4℃、 10000r/min‘ 30min离心,取上清液测定β-葡萄糖苷酶活。
1.2.3酿酒酵母工程菌细胞的固定化方法
1.2.3.1酿酒酵母的活化
将酿酒酵母工程菌NAN-27在YPD固体平板上划线,28℃恒温培养24h,使其活化。
将酿酒酵母工程菌NAN-28在YpD固体平板 (G418,5000林g/mL)上划线,28℃恒温培养24h,使其活化。
1.2.3.2酿酒酵母工程菌种子的制备
挑取活化后的酿酒酵母NAN-28单菌落,转接于YPD液体培养基中,30℃恒温培养至对数期。
1.2.3.3配制4%的CaCI:溶液
称取无水CaCI:89放入 500mL烧杯中,加入 200mL的蒸馏水使其充分溶解,待用。
1.2.3.4配制海藻酸钠溶液
101称取一定量的海藻酸钠,放入 100mL小烧杯中。加入 20mL水或生理盐水,用酒精灯加热,边加热边搅拌,将海藻酸钠调成糊状,直至完全溶化,用相同溶剂定容至 20mL。
注意,加热时要用小火,或者间断加热,反复几次,直到海藻酸钠溶化为止。
1.2.3.5海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温,加入培养好的酿酒酵母NAN-28种子细胞,进行充分搅拌,使其混合均匀,再转移至注射器中。
1.2.3.6固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到己配制好的CaCI:溶液中,观察液滴在CaCI:溶液中形成凝胶珠的情形。制成直径约为Zlnm的珠状固定化细胞。4℃静置sh,充分硬化,滤去溶液,用灭菌水和0.5%CaCI:溶液分别冲洗数次,将固定化细胞悬浮在0.5%CaCI:溶液中,4℃保存备用[204]。
1.2.3.7纤维二搪转化率
纤维二糖转化率=己消耗的纤维二糖/总纤维二糖。
1.2.4固定化酵母细胞发酵方法
1.2.4.1固定化细胞的增殖
将制成的固定化凝胶放入种子培养基中,在35℃下静置培养12h,增殖后的固定化细胞用于发酵稻草纤维素酶处理液。
1.2.4.2分批发酵
在 250mL三角瓶中分别加入  150mL发酵培养基I、发酵培养基11,酵母接种量10%,在30℃下静置培养24h。测定发酵液的糖浓度与乙醇浓度。
1.2.4.3连续分批发酵
在 250mL三角瓶中加入  150mL发酵培养基I,接种量10%,在30℃下静置培养24h。倾出发酵液,加入发酵培养基I重复进行发酵。测定每批发酵液的糖浓度与乙醇浓度。
1.2.5分析方法
1.2.5.1纤维素酶活测定参考本文第二章1.2.7。
1.2.5.2葡萄糖、纤维二糖和乙醇的测定
发酵液经 13000r/min离心15min,以0.22μm醋酸纤维滤膜过滤,滤液适当稀释后用高压液相层析(HPLC)分析。层析柱 AminexHPX一87H(Bio一Rad,USA)离子交换柱,流动相为 0.05mol/LH2s04,流速为  0.4mL/min,柱温55℃,甩。一loA(shimadzu,Japan)102折光检测仪[205]。

2结果与分析

2.1表达BGLI基因的重组菌株的构建结果

2.1.1目的基因BGLI的获得
以扣囊复膜酵母染色体DNA为模板,用上述引物进行PCR扩增,得到 2.6Kb左右的DNA的片段BGLI,PCR产物电泳图如图6一3所示,与文献报道结果一致。
 
图6-3PCR扩增BGLI电泳图
2.1.2含目的基因BGLI重组质粒的构建
回收PCR产物,经BamHI酶切处理,与事先经BGLll酶切并去磷酸化处理载体pYMIKp连接。连接体系40μL中含有 loxT4Buffer4μL,BGLI片段25μL,载体pYMIKp9沙, T4LigaseZ卜L,重蒸水14μL。16℃过夜,获得重组质粒pYMIKβ-BGLI。
将连接液转化E.。 011DH5a,得到转化子,随机挑取一定数量的转化子,小量制备质粒,以万了月dlll酶切电泳分析的方法确定基因连接方向。选取正确表达方向,得到携带BGLj基因的酵母重组质粒pYMIKΒ-BGL了(图6-4)。
 
图6-4重组质粒Pymikp-BGL1电泳图
  M:7kbDNA标准;1:重组pYMIKΒ-日弘1质粒。
  M:7kbDNAladder:l:PlasmidPYMIKΒ-BGLI.
2.1.3酿酒酵母工业菌株NAN-27转化子的获得
在含 G418(400林g/mL)的选择平板,30℃恒温培养3一4天,筛选得到21个转化子,由于载体质粒pYMIKP上G418抗性基因与BGLI基因串联,所以可以通过分析对G418耐受性的高低不同,筛选不同拷贝数的整合菌株。将得到的高拷贝整合菌株,因此将转化子在含  G418(1000回mL,5000叫mL)的YPD平板上复筛,得到一株对G418耐受性高的重组菌株NAN-28。
2.1.4转化子NAN-28细胞纤维二糖酶活性测定结果
将NAN-27与NAN一8单菌落接种于YNBC培养基中30℃培养48h后测定OD600。
接种于YEPD培养基中30℃培养48h后收集菌体,加入柠檬酸缓冲液和裂解液,漩涡震荡破碎细胞,4℃、10000甲m‘10min离心,上清液采用DNs法测定β-葡萄糖苷酶酶活。结果见表6一2。从结果可以看出,转化子NAN-28能以纤维二糖为唯一碳源生长,亲代酵母不能利用纤维二糖,但由于高温灭菌,培养基中二糖会部分分解,因此亲代在YNBC培养基中能少量生长。酶活性测定数据也显示:β-葡萄糖苷酶基因BGLI在酿酒酵母工业菌株中已经得到正确表达。表6-2转化子酶活和生长
几ble6一    2Enzymeassayandgrog/l  hofreeombinant
菌株NAN-27NAN-28
酶活(IU/mL)  0.002:I=0.0001 0.732士0.0021*
OD600 0.097士0.0002  0.318土0.0014*
注:*,与NAN-27单菌落相比,P>0.05。
Note:*, vsNAN一 27elone, P>0.05.

2.2不同固定化条件对NAN-28细胞固定化的影响结果

2.2.1不同溶剂对固定化细胞转化纤维二糖的测定结果
分别以蒸馏水和生理盐水为溶剂,配置2%海藻酸钠溶液,15%NAN-28菌量,均匀混合后制成直径约为Zlnm的珠状固定化细胞。加入等量YNBC培养基于30”   C100r/min振荡培养48h。测定纤维二糖转化率,其结果见表6一3。
表6-3不同溶剂制备的SA颗粒对纤维二糖转化率和SA颗粒性状的影响
几ble6一                3EffeetsofSAindifferentsolutionsontheeonellioneeonversionrateandProPertyofSAPlasin
溶剂蒸馏水生理盐水
SA颗粒性状手捏有软化现象,粘度略有增加无变化
纤维二糖转化率(%)47.2士  1.00846.9士  1.123
从表6-3可以看出,以蒸馏水和生理盐水为溶剂配制海藻酸钠溶液对纤维二糖的转化率影响不明显,但观察SA颗粒性状,以生理盐水做为溶剂优于蒸馏水,说明离子成分对SA固定化颗粒的结构和强度有一定的影响。因此选择生理盐水做为海藻酸钠固定化颗粒的溶剂。
2.2.2不同海藻酸钠浓度对固定化细胞凝胶特性的影响
不同的SA浓度在4%氯化钙溶液中固定化成球不一样,以生理盐水为溶剂,分别配成1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的海藻酸钠溶液用于制备SA颗粒,加入等量YNBC培养基于30“ CIO0r/min振荡培养48h,测定纤维二糖转化率,结果见表6-4。
表6- 4SA浓度对纤维二糖转化率和SA颗粒的影响
Table6一             EffeetsofSAwithdifferenteoneentrationsontheeonellioneeonversionrateandSAPlasin
SA浓度   (%)1.52.02.53.0
纤维二糖转化率(%)52.3土 2.33947.1土 2.07646.7士 1.22326.4士1.007
凝胶强度低,易破碎较低,无破碎中等高,固定化难以进行
105表6-4结果的统计学分析表明:3%SA浓度与其余各组之间差异显著(p<0.05),其余各组之间两两比较均无显著性差异。可以看出:当海藻酸钠浓度低于1.5%时,颗粒易破碎,酵母细胞游离出来,纤维二糖转化率较高。随着载体浓度的提高,强度加大,有利于固定化细胞的重复使用,然而随着载体浓度的增大,载体溶液粘度增加,网络空隙亦随之变小,凝胶内外底物分子的扩散阻力增加,不利于酵母细胞的增殖和底物的扩散传递。因此本实验固定化细胞SA浓度以2.5%为宜,既能有较高的发酵能力,又有利于重复使用。
2.2.3酵母包埋量对固定化细胞转化纤维二糖的影响结果
以生理盐水为溶剂,改变酵母包埋量,海藻酸钠浓度2.5%。加入等量YNBC培养从于 30℃100r/min振荡培养48h,测定纤维二糖转化率,结果见表6-5。
表6-5酵母含量对纤维二糖转化率的影响
Table6一        5Effeetsofamountsofyeastontheeilliboneeonversionrate
酵母用量(%)纤维二糖转化率(%)凝胶颗粒
 527.1士1.992完整
 1038.肚1.324完整
 1546.4士2.339完整
 2052.3士2.963部分破碎,发酵液浑浊
表6-5结果的统计学分析表明:各组之间两两比较差异均有显著性意义(p<0.05),以5%酵母用量最低,20%酵母用量最高。可知,随着包埋酵母量的增加纤维二糖转化率明显提高,但当酵母包埋量达到15%时,胶体强度开始减弱,洗涤时酵母出现轻微泄漏,当包埋量达到达20%时,反应完毕后可见部分颗粒破碎,溶液浑浊,因此选取包埋量为15%为宜。
通过以上实验,得到酿酒酵母工程菌NAN-28固定化的最佳条件为:以生理盐水为溶剂,配制2.5%的海藻酸钠溶液,酵母包埋量为15%。

2.3固定化细胞与游离细胞分批发酵实验结果

在稻草水解液中,分别利用NAN-28固定化细胞和NAN-27、NAN-28游离细胞进行乙醇发酵,接种量10%,30℃发酵48h。试验结果如表6一6所示。
由表6-6可知:在同种培养基中,NAN-28固定化细胞的发酵周期比NAN-28游离细胞明显缩短,发酵终点时发酵液中的残余葡萄糖浓度较低,而乙醇浓度较高,乙醇得率分别比NAN-28、NAN-27游离细胞有显著提高。这可能是因为固定化细胞的菌体密度比游离细胞大得多,所以反应速度快,生产效率高。在游离细胞发酵过程中,发酵初期需要消耗一部106分糖用于菌体生长;而在固定化细胞发酵条件下,则可省去这一部分糖的消耗,而且发酵培养基限制了氮源,使得细胞在固定化凝胶珠中主要进行乙醇生产,而不是进行细胞增殖,因而乙醇得率明显提高;此外,海藻酸钙包埋形成的固定化环境非常适合厌氧菌发酵是提高乙醇得率的又一原因。
表6-6固定化细胞发酵纤维素水解液生成乙醇的时间进程
Table6一        6Timecoursesofethanolfermentationbyimmobilizedeellsusingeellulosiehydrolysate
菌株NAN一 27NAN-28IAI定化NAN-28
发酵培养基     111111111
残余葡萄糖
0.332士 0.0050.356士 0.0020.298士 0.0030.290士 0.0020.324士 0.0040.231士0.003
浓度(g/l)
残余纤维二
 3.408士 0.0923.242士 0.1332.433士 0.1171.875士  0.0710.787士0.023*#0.792士0.011*却
糖浓度(g/L)
乙醇含量
 6.101士 0.0378.10肚 0.2466.337士 0.2398.65妊 0.22710.25妊0.112*#10.360士0.199*#
(g/l)
注:*,与同种培养基NAN-27游离细胞相比,P>0.05;’,与同种培养基NAN-28游离细胞相比,P>0.05。
Note:*, vsNAN一  27freecel一    5inthesamemedium,p<0.05;#, vsNAN一  25rreeee一    5inthesamemedium,
 P>0.05.
从不同培养基的发酵结果可以看出,对于NAN-27和NAN-28游离细胞,高温灭菌的培养基比添加氨节青霉素的培养基培养效果要好,乙醇得率高,这可能是由于纤维素酶的存在,对酵母细胞壁造成一定的损伤,使得酵母发酵能力下降,发酵周期延长。而对于固定化细胞则可以防止这一损伤,因此,在两种不同处理的培养基中,固定化细胞发酵能力相当。由此试验结果表明固定化细胞比游离细胞更能有效地利用纤维原料水解液,缩短发酵周期,提高生产效率,适合工业化生产。

2.4固定化细胞重复分批发酵试验结果

利用同一批固定化细胞重复分批发酵纤维素水解液生成乙醇,一共进行了10批。结果见表6-7。表6-7显示:该固定化细胞十批发酵的乙醇生产能力无显著性差异,乙醇浓度最高为11.67g/L,最低为10.18g/l,每一批的纤维二糖浓度均不超过1.000g/l,符合生产的要求,可以用于连续分批发酵。表6一7固定化细胞利用纤维素水解液重复分批发酵结果
Table6一          7ResultsofrePeatedbatehesfermentationbyeellulosiehydrolysateonimmobilizeds.eereieveeells
发酵批次残余葡萄糖浓度(g/l)残余纤维二糖浓度(g/l)乙醇浓度(g/l)
   10.4350.76911.35
  11.67
10.87
10.64
10.93
 11.67
  11.12
 11.05
10.68
      4568346443028475O八︸了bt,71乎 10001八︶了6n“nU︵Ijn月︸nU︸11︸n八”      4761296834626836,J︸、以,︸,J片月,J气j,J八”八”︸︷日︺ nllnU︺ nUCU日一︸,︸气、︸片心月J石U工了01八︸八,
   100.2840.78310.18

3结论与讨论

3.1酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建

构建能利用纤维二糖生产乙醇的代谢工程菌的最终目的是用于大规模的、粗放的乙醇生产。因此,在获得高表达纤维二糖酶基因的同时,需要选用发酵性能优良的、适于工业生产的工业酿酒酵母作为代谢工程改造的宿主菌。工业酿酒酵母菌不同于实验室菌株,它与实验室菌株的差别在于:(l)工业酿酒酵母菌一般是二倍体或多倍体,只产生少量抱子或不产生饱子;(2)具异源基因型;(3)不具有营养缺陷标一记,即原养型。因此,工业酿酒酵母菌的转化系统也于实验室菌株有一定的差别。
在对酵母工业菌株进行代谢工程手段改造时,为了实现外源基因的稳定表达,需要利用同源重组将外源基因整合到酵母工业菌株染色体上。酵母工业菌株的整合策略一般有以下两种:一是共转化方法,即把抗性标记基因(如G418抗性基因)构建在附加体质粒上,目的基因构建在整合载体上,共转化宿主细胞,在抗性转化子中筛选含有目的基因的转化子,经完全培养基连续传代培养即可得到去除抗性标记基因的转化子。共转化方法不仅可实现目的基因的稳定表达,还可方便的去除标记基因。第二种整合策略是将抗性标记基因直接连接到带有目的基因的整合载体上,筛选到的抗性转化子即为含有目的基因的转化子。但是共转化方法在抗性转化子中筛选到含目的基因转化子的几率为0.3个八oo个抗性转化子1206]。工业酵母菌的低转化效率不能满足共转化要求的大量转化子筛选的需求,共转108化方法的应用受到极大限制。因此,本实验室构建了适用于酿酒酵母工业菌株的多拷贝整合表达载体pYMIKP。其构建流程图见图6-5。
 
图6-5质粒pYMIKP的构建流程图
该载体带有适用于工业酵母转化的G418显性选择标记,PGK酵母强启动子用于表达外源基因,同时以酿酒酵母  2.2kbrDNA片段替换骨架质粒YIPS中的。天月3基因,用于外源基因在染色体rDNA区域高拷贝整合,其线性化位点为HPall207]。将载体pYMIKP转化工业酵母菌,经含G418的选择平板筛选,得到的具有G418抗性的转化子大多带有目的基因,从而大大减少了转化子筛选的工作量,对工业菌株转化效率的要求也不是很高,因而适合于酵母工业菌株代谢工程的改造。
为克服附加体质粒及实验室菌株存在的缺陷,本工作以生产乙醇性能优良的酿酒酵母菌株NAN-27作为工程菌株的受体菌。在建立了酿酒酵母工业菌株转化系统的基础上,利用稳定性能良好的整合型载体pYMIKP,使纤维二糖代谢基因BGL!整合到酿酒酵母的染色体上,转化子接种到YPD液体培养基中连续培养50代(每24h为10世代)。每隔10代进行一次整合质粒在非选择性培养条件下的稳定性测定,50世代后整合质粒仍有97%以下存在于酵母细胞中,说明在无选择压力下,重组质粒在酵母细胞中的稳定性很好。从而将纤维二糖代谢途径引入酿酒酵母工业菌株NAN-27,在酿酒酵母工业菌株中建立了稳定的纤维二糖代谢途径,拓展了酒精生产的底物利用范围,降低了纤维二糖对纤维素酶解的抑制作用。质粒pYMI甘在连续培养时稳定性良好,可以满足工业化生产中长期无选择压力培养的生产条件。该酿酒酵母工程菌对木质纤维材料的高效和全利用具有重要的意义。

3.2酿酒酵母工程菌细胞固定化

微生物的酶通常可被分为胞外酶和胞内酶。胞外酶由微生物细胞合成后分泌到培养基中,而胞内酶则在整个培养过程中始终保留在细胞内或细胞表面,只有当细胞裂解后刁‘能释放到培养基中,因此,在使用胞内酶时,应先将其由细胞内提取出来,由此给酶固定化带来了许多麻烦,同时也增加了成本。因而,采用微生物细胞固定化技术取代酶固定化技术成为了必然。微生物细胞固定化技术的优点是可避免复杂的酶提取和纯化过程,同时也解决了酶的不稳定性问题,并且细胞经固定化后酶活性通常较高,操作稳定性也较好。
本工作采用海藻酸钙凝胶包埋固定化的酿酒酵母工程菌,海藻酸钠(SA)的分子式为(CsH80:)n,聚合度n可以为80~750,分子量为14000~132000。其中海藻酸系天然有机高分子电介质,其一价盐(Na+、K+、NH4+)为水溶性盐,而二价以上的盐(c扩十、A13十)为水不溶性盐,因此可形成耐热的凝胶或被膜,这是海藻酸钠经CaCI:溶液钙化后形成固定化凝胶的内在机理。同时,海藻酸钠易与蛋白质、明胶等多种物质共溶,并可与细胞混合形成均匀的悬浮液,使凝胶具有微生物分布的均匀性。除此之外,海藻酸钠还具有易于成形,无毒、不易被大多数微生物降解、成本低廉等良好特性,是目前应用最为广泛的一种固定化载体。发酵试验证明:与游离细胞相比,海藻酸钙凝胶包埋固定化的酿酒酵母细胞发酵周期明显缩短,乙醇得率提高了20%以上。利用纤维原料水解液发酵生产乙醇,固定 110化细胞发酵能力明显优于游离细胞,具有显著性差异(p<0.05)。
固定化细胞重复分批发酵纤维素水解液的试验也表明:固定化细胞性状稳定,产乙醇能力较强,由于酵母细胞被固定在载体上,因而它们在反应结束后,还能够反复使用,并在贮存较长时间后依然保持微生物的活性不变。因此该技术大大提高了酶促反应效率,并能够进行自动化、管道化等连续化生产,不仅降低了生产成本,而且提高了产品质量。


第七章串联式生物反应器转化

水稻秸秆生产燃料乙醇的研究纤维原料生物转化燃料乙醇的过程主要包括纤维素酶解糖化和酒精发酵两个步骤,其中酶水解过程是限速步骤1209,2’μL。纤维素大分子的降解需要纤维素酶各组分的协同作用,纤维素酶是一个多组分的复杂多酶体系:纤维素酶解反应也是多相催化反应,与酶的均相反应相比,反应过程非常复杂。在此过程中,纤维二糖的积累会对纤维素酶解造成强烈的反馈抑制作用;同时水解终产物葡萄糖的累积也会对纤维素酶形成反馈抑制。因而,利用酿酒酵母将水解产生的纤维二糖和葡萄糖转化为目标产物乙醇,及时去除纤维二糖和葡萄糖对水解的影响,是提高纤维素水解得率,进而增加乙醇得率的关键措施。
本章利用YT02发酵得到的纤维素酶,首次研究了其对经过不同预处理的稻草粉的酶解过程,并探讨了纤维素酶浓度和底物浓度等因素对稻草粉酶解反应的影响。优化酶解条件,并将具有纤维二糖代谢能力的固定化酿酒酵母工程菌和纤维素的酶水解有机地祸合在串联式生物反应器中,加强了纤维素酶的协同降解作用,提高纤维素对乙醇的转化率。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂
水杨素、梭甲基纤维素钠购自sIGMA公司;试验中所用其它试剂均为分析纯。
1.1.2菌种
酿酒酵母NAN-28代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌,以NAN-27为宿主菌改造得到;酿酒酵母NAN-28固定化细胞柱:将制成的固定化凝胶放入种子培养基中,在35℃下静置培养12h,增殖后装柱。
1.1.3主要仪器与设备
HYG一n转式恒温调速摇瓶柜;751一GW分光光度计;LGRIO一4.2台式高速冷冻离心机;PHS-gV型酸度计;Sartorius电子天平;Electrolux冰箱;电热恒温培养箱;立式圆形LS一 B50L型压力蒸汽灭菌器。

1.2方法

 1.2.1稻草粉的预处理称取稻草粉,预处理见第二章1.2.1。
1.2.2纤维素酶的制备
将发酵液离心 10min,除去固形物和菌体,得上清液即为粗纤维素酶液,缓慢加入70%饱和度的硫酸铵,溶解后,静置过夜,抽滤得酶泥,将酶泥溶于pHS.O的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液中,制得纤维素酶(来自YT02,CMC酶活为  18800IU/mL,滤纸酶活为 450IU/mL,β-葡萄糖苷酶活为 190IU/mL),置于4℃保存备用。
1.2.3 稻草粉的酶解糖化
1.2.3.1不同预处理对水稻秸秆酶解糖化的影响
在 250mL具塞三角瓶中,分别加入 2mL稀释适当倍数的纤维素酶液和 0.05mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液  (pH5.0)至  100mL,加入29经 10, 0Hel、 10, 0NaoH和 10,  0Hel+10, 0NaoH预处理的稻草粉、充分摇匀,将上述三角瓶放入恒温水浴震荡器中,在转速 100r/min,温度50℃, pH5.0的条件下进行反应。在不同反应时间内,分别取 1mL酶解液测定溶液中的葡萄糖和纤维二搪,计算搪化率。
1.2.3.2不同糖化温度对水稻秸秆酶解糖化的影响
在 250mL具塞三角瓶中,分别加入 2mL稀释适当倍数的纤维素酶液和 0.05mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液  (pH5.0)至  100mL,加入29经 l%Hel+10, 0NaoH预处理后的稻草粉、充分摇匀,将上述三角瓶放入恒温水浴震荡器中,在转速 100r/min, pH5.0和不同温度条件下进行反应。在不同反应时间内,分别取 1mL酶解液测定溶液中的葡萄糖和纤维二糖,计算糖化率。
1.2.3.3不同pH值对水稻秸秆酶解糖化的影响
在 250mL具塞三角瓶中,分别加入2mL稀释适当倍数的纤维素酶液和不同pH值的0.05mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液至 100mL,加入29经1%HCI+l%NaOH预处理后的稻草粉、充分摇匀,将上述三角瓶放入恒温水浴震荡器中,在转速 100r/min,温度 50℃, pH5.0条件下进行反应。在不同反应时间内,分别取 1mL酶解液测定溶液中的葡萄糖和纤维二糖,计算糖化率。
1.2.3.4不同酶加量对水稻秸秆酶解糖化的影响
在 250mL具塞三角瓶中,分别加入 2mL不同酶活性的纤维素酶液和 0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 (pH5.0)至 100mL,加入29经l%HCI+l%Na0H预处理后的稻草粉、充分摇匀,将上述三角瓶放入恒温水浴震荡器中,在转速 100r/min,温度50℃, pH5.0条件下进行反应48h,分别取 1mL酶解液测定溶液中的葡萄糖和纤维二糖,计算糖化率。
1.2.3.5不同底物浓度对水稻秸秆粉糖化的影响
在 250mL具塞三角瓶中,加入 2mL稀释适当倍数的纤维素酶液和 pH5.0的 0.05mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液至 100mL,加入不同质量的经1%HCI+l%NaOH预处理后的稻草粉、充分摇匀,将上述三角瓶放入恒温水浴震荡器中,在转速 100r/min,温度50℃, pH5.0条件下反应48h,分别取 1mL酶解液测定溶液中的葡萄糖和纤维二糖,计算糖化率。
糖化率(%):(生成的葡萄糖(g)*0.9十生成的纤维二糖(g)*。  .95)x100/稻草粉纤维素量(g)
1.2.4水稻秸秆生物转化燃料乙醇
1.2.4.1水稻秸秆同步糖化发酵转化燃料乙醇(SSF)
在 250mL具塞三角瓶中加入经  1.0%HCI+l.0%NaOH预处理的稻草粉,浓度为10%,添加适量的(N玩)250;(浓度为 1.0%),反应体系pHS.o,灭菌,按酶加量 15IU/g力fl入过滤除菌后的纤维素酶50℃酶解sh,调节温度为35℃,按10%体积接入不同酵母种子液或固定化酵母细胞,在35℃静置培养48h后测定乙醇产量。
 1.2.4.2二级串联式生物反应器转化燃料乙醇
将酶解罐与NAN-28固定化细胞柱相祸联,工艺流程如图7-l所示
图7一1三级串联式生物反应器中协同酶解发酵的工艺流程
l酶解罐;2固定化细胞柱;3搅拌装置;4阀门;5过滤装置;6培养基贮罐;7蠕动泵;8流最计。
2L酶解罐的工作体积为1.4L,采用经 1.0%HCI+l.0%NaOH预处理的稻草粉作为酶解底物,加入 2mL稀释不同倍数的纤维素酶液和 0.05mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(pH5.0),在转速 100r/min,温度 50℃, pH5.0的条件下进行预酶解sh。酶解液通过蠕动泵压出,由过滤装置除去固形物质。经培养基贮罐后,与酒精发酵所需的其他营养物质(酵母粉:1%,蛋白胨2%)混合均匀,然后一同进入装填有 120mL固定化酵母凝胶颗粒的柱式反应器 (250mL,内径2.scm,内高 40cm)。过柱后的发酵液由蠕动泵送回酶解罐中,如此不断循环。定时取样分析,测定酶解罐出口处的糖浓度和固定化细胞柱出口处的糖浓度和乙醇浓度。计算纤维素对乙醇的转化率和反应器的生产效率。
纤维素对乙醇的转化率(%卜(生成的乙醇含量*100*0.9)/底物中的纤维素含量纤维素对乙醇的理论转化率(%)=100*1.11*0.51=56.61%生产效率(留(L·h))=生成的乙醇量(g/l)/发酵时间(h)。
1.2.4.3串联式生物反应器的稳定性
在串联式生物反应器中进行重复分批酶解发酵乙醇试验,每一批反应结束时,收集发酵液,倾出酶解罐中的残渣,加入新的纤维底物、纤维素酶和发酵所需的营养物质,继续利用原有固定化NAN-28酵母细胞进行协同反应。
1.2.4.4分批添料式协同酶解发酵生产燃料乙醇
在NAN-28固定化细胞二级串联批式反应的基础上,于12h、24h、36h、48h时分别添加359经预处理的稻草粉,使纤维底物的终浓度增加到200g/l;同时在24h、48h时按照10IU德底物的酶加量分别补加纤维素酶,并延长反应时间至72h结束。反应过程中在固定化细胞柱出口处定时测定发酵液各成分浓度,并计算纤维素对乙醇的转化率和反应器的生产效率。
1.2.5测定方法
1.2.51pH的测定
用PHS-gV型酸度计测定。
1.2.5.2纤维素、半纤维素和木质素的测定
参考王玉万的方法。
1.2.5.3残余还原糖的测定
DNs测定法。
1.2.5.4纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定见第二章[’川。
1.2.5.5葡萄糖、纤维二糖和乙醇的测定
发酵液经 13000r/min离心15min,以0.22μm醋酸纤维滤膜过滤,滤液适当稀释后用高压液相层析(HPLC)分析。层析柱 AminexHPX一87H(Bio一Rad,USA)离子交换柱,流动相为  0.05mol/LHZsO4,流速为 0.4mL/min,柱温55℃,RID一loA(Shimadzu,Japan)折光检测仪。

2结果与分析

2.1不同预处理方法对水稻秸秆糖化效果的影响结果

过80目的稻草粉经l%的盆酸、氢氧化钠预处理后,按照1.2.3进行糖化实验,在不同时间取样,测定葡萄糖和纤维二糖,计算糖化率,实验结果见图7-2。
图7-2不同预处理对稻草粉糖化的影响
注:*,与未经处理的稻草粉相比,P>0.05;’,与未经处理的稻草粉相比,p<0.01.
由图7-2可以看出,未经预处理的稻草粉糖化率很低,酶解24h糖化率仅为9.5%,酶解48h糖化率仅为10.5%,预处理后的稻草粉的糖化率迅速增加,稻草粉以经1%HCI+l%NaoH预处理后,糖化效果优于其它处理,这可能是因为稻草粉预处理后,部分除去了木质素和半纤维素,底物润胀,增大了纤维素酶与底物接触机会,提高了纤维素酶的水解作用。

2.2不同温度对水稻秸秆糖化效果的影响结果

在不同温度下对经1%HCI+l%NaOH预处理后的稻草粉进行水解糖化,实验结果见图7-3。
图7-3不同糖化温度对稻草粉糖化的影响
图7-3结果的统计学分析表明:从4h开始,糖化温度为50℃的各个时间点的糖化率与其它温度对应糖化率相比,差异均有显著性意义(p<0.05)。可以看出,当糖化温度为50℃时,稻草粉的糖化率最高,这与纤维素酶的最适反应温度相一致。

2.3不同pH对稻草粉糖化效果的影响结果

用不同pH的柠檬酸一柠檬酸钠和磷酸缓冲液分别配制2.0%的稻草粉溶液,在50℃进行糖化实验,考察pH对稻草粉酶解糖化的影响,结果如图7-4所示。
图7-4不同pH对稻草粉糖化的影响
图7-4结果的统计学分析表明:从4h开始,pH值为5.0的各个时间点的糖化率与其它pH值对应糖化率相比,差异均有显著性意义(P>0.05)。可以看出,当反应体系的pH为 5.0时,糖化率最高,当pH为6.0或7.0时,糖化率明显下降。

2.4不同加酶量对稻草粉糖化效果的影响结果

纤维素的酶解糖化是纤维素酶多组分协同作用的结果,因此纤维素酶的用量对稻草粉糖化效果的影响较大。本文研究不同加酶量反应48h后的糖化率,结果见图7-5。
图7-5不同加酶量对稻草粉糖化的影响
图7-5结果的统计学分析表明 :5Iu/g和 10Iu/g加酶量与其它各组之间有显著性差异(p<0.05),其余各组间无显著性差异。可知,当酶加量小于 15IU/g时,随着酶加量的增加,糖化率上升:当酶加量大于 15IU德时,随着酶加量的增加,搪化率变化不明显,因此对于经1%HCI+l%Na0H预处理后的稻草粉,酶加量以  15IU/g为宜。

2.5不同底物浓度对稻草粉糖化效果的影响结果

分别配制2~20%的经1%HCI+l%NaOH预处理后的稻草粉溶液,酶加量  15IU/g,50℃糖化48h。研究底物浓度对糖化率的影响,实验结果图7-6。
从图7-6可以看出,水稻秸秆浓度对糖化率影响显著(p<0.05),当水稻秸秆的浓度为2%时,糖化率最高,但糖浓度最低。通常为了提高后续发酵步骤的效率,希望增加酶解液中的还原糖浓度,因而需要提高酶解底物浓度。随着稻草粉浓度继续升高,糖化率出现下降趋势,葡萄糖和纤维二糖浓度增大,但当底物浓度大于ro%时,酶解产生的纤维二糖和葡萄糖对酶解产生很强的抑制作用,通过增加底物浓度来提高的糖含量明显减少。反应器中传质阻力迅速加大,产物的反馈抑制作用更为明显,使得底物利用率不高。因此,宜选用10%的底物浓度来进行糖化。
图7-6不同底物浓度对稻草粉糖化的影响
通过单因子实验,可以初步得到稻草粉酶解糖化的最佳条件:稻草粉经 1.0%HCI+l.0%NaoH预处理;稻草粉浓度为10%,糖化温度50℃,反应体系pHS.o,酶加量 15Iu/g。
2.6水稻秸秆同步糖化发酵(SSF)结果
在 250mL具塞三角瓶中加入经  1.0%HCI+l.0%NaOH预处理的稻草粉,浓度为10%,添加适量的创H4)250;(浓度为 1.0%),反应体系 pH5.0,酶加量 15IU/g底物,按10%体积接入不同酵母种子液或固定化酵母细胞,在 35℃静置培养48h后测定乙醇产量。结果见表7-1。
表7-1不同菌种发酵产乙醇的比较
Table7一    1CaPabilityofethanolProduetionofdifferentyeasts
菌种NAN-27NAN-28
残余葡萄糖(g/l)
残余纤维二糖糖(g/l)
酒精(g/l)
纤维素对乙醇转化率(%)
 0.236士0.017 0.329士0.022
 3.547士 0.1131.87肚0.098
10.52士0.776 11.75士0.288
固定化NAN-28
0.48肚0.052*#
 0.618土0.033*#
15.43士0.276*#
18士 2.392肚 2.9926士 2.43*#
注:*,与NAN-27游离细胞相比,P>0.05;‘,与N^N一28游离细胞相比,p<0.05.
由表7-1可知:采用游离细胞和固定化细胞进行同步糖化发酵(SSF),将纤维素的酶解糖化与乙醇发酵祸合在一起,随着纤维素水解形成的葡萄糖被迅速转化为乙醇,葡萄糖对酶水解的反馈抑制被消除,纤维素的糖化效率与乙醇产量都得到了明显提高。但游离的酿酒酵母细胞必须经过一个生长和积累过程后刁‘能进入发酵阶段,而这一过程需要消耗葡萄糖和其它营养物质,同时也延长了反应时间;而固定化细胞转化效率明显高于游离细胞,并且发酵周期缩短,游离细胞整个发酵周期需要60h,酒精终浓度均值为11.75g/l,生产效率均值为0.20留(Lh);而固定化细胞只需48h,酒精终浓度均值为 15.43g/L,生产效率均值为0.32创(Lh),是游离细胞的1.6倍。
另外,纤维素酶、酿酒酵母细胞和纤维素原料共处一个反应器中,纤维素原料的比容较大,底物浓度与产物的浓度都将受到限制,这种情况下乙醇的分离提取成本也将会有所提高。

2.7串联式反应器转化水稻秸秆生产乙醇

2.7.1固定化NAN-28细胞发酵生产燃料乙醇结果
利用二级串联式反应器,采用NAN-28固定化细胞发酵,将水稻秸秆的酶水解与乙醉发酵相祸联(图7-1)。糖化罐温度恒定50℃,发酵柱恒定温度30℃,发酵祸联反应的时间进程如图7-7。
图7-7纤维原料酶水解与固定化细胞发酵相祸联的反应进程
由图7-7可知:反应初期底物被迅速降解,反应周期可缩短至40h,此时乙醇浓度为25.5g/l,纤维素对乙醇的转化率达43.0%,是游离细胞同时糖化发酵(SSF)的1.65倍,生产效率达0.64创(L.h)。反应过程中无纤维二糖累积现象,同时固定化细胞柱内乙醇快速生成,浓度呈直线增长,32h后乙醇浓度增长随着葡萄糖含量逐渐下降趋于平缓,发酵终点时,酶解罐中纤维底物的剩余量显著减少,发酵48h,发酵液中己测不到葡萄糖的含量,乙醇浓度达28.3g/L,纤维素对乙醇的转化率达48.0%,是游离细胞同时糖化发酵(SSF)的2.43倍,但生产效率较发酵40h低,为0.599/(Lh)。乙醇浓度提高的量不足以抵消延长发酵的生产成本,因此,以发酵40h为发酵终点。
通过二级串联式反应器,在未增加水解酶成本、其它设备和工艺的情况下,代谢纤维二糖的固定化酵母工程菌细胞不断将葡萄糖和纤维二糖转化为乙醇,及时消除了因葡萄糖和纤维二糖的积累而引起的对纤维素酶的底物抑制作用,糖化和酒精发酵均处于最适反应温度下进行,提高了纤维素对乙醇的转化率及乙醇的生产效率,提高了葡萄糖利用效率,与采用游离细胞的SSF过程相比,固定化酵母细胞还具有细胞密度高、可重复使用和便于自动化控制等优点,发酵时间大为缩短,发酵效率明显提高,同时终产物乙醇易于分离纯化,因而对于优化反应工艺,降低操作成本具有重要意义。
2.7.2串联式生物反应器的稳定性结果
在串联式生物反应器中进行重复分批酶解发酵乙醇试验,每一批反应结束时,收集发酵液,倾出酶解罐中的残渣,加入新的纤维底物、纤维素酶和发酵所需的营养物质,继续利用原有固定化NAN-28酵母细胞进行协同反应,重复10批试验的结果见图7-8。
图7-8二级串联式生物反应器中重复分批酶解发酵乙醇的结果
图7-8表明十批发酵乙醇浓度与纤维素对乙醇的转化率变化均不显著。说明该串联式生物反应器性能稳定,生产效率高,固定化细胞可以重复利用,10批反应中纤维素对乙醇的转化率平均为43.54%,其中最高46.51%,最低40.72%。
2.7.3分批添料式协同酶解发酵生产燃料乙醇结果
在水稻秸秆酶解发酵乙醇的过程中,提高底物浓度有助于获得较高的产物浓度,但底物初始浓度太高,会造成料液过于粘稠,搅拌阻力大太,也不利于纤维素酶与底物的接触,不利于酶解反应的进行,本工作通过分批添料技术较理想地解决了这一问题,发酵结果见图7-9。
图7-9二级串联式生物反应器中分批添料协同酶解发酵进程
由图7-9可知:与分批发酵工艺中的一次加料相比,分批添料使纤维底物的终浓度增加了200g/L,纤维素对乙醇的转化率为46%,乙醇终浓度达到53.8g/L。此外分批添料工艺的发酵周期为68h,对于转化等量底物而言,反应时间较一次加料工艺明显缩短。生产效率提高到0.79g/(Lh)。

3结论与讨论

3.1二级串联式生物反应器生产乙醇

将纤维原料酶水解与代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌固定化细胞酒精发酵相祸联,可有效地去除纤维素酶解过程中纤维二糖和葡萄糖的反馈抑制作用,促进水稻秸秆的糖化。纤维素对乙醇的转化率达46%(理论转化率为56.61%),生产效率为0.79留(L·h)。与在同一反应器中利用游离酵母细胞进行同步糖化发酵(SSF)过程相比,底物的利用率提高,发酵时间缩短12h,纤维素对乙醇的转化率提高20%,且固定化细胞可以重复使用,产物乙醇易于分离纯化。该二级串联式生物反应器,由于采用了代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌作为固定化细胞,无需再串联固定化纤维二糖酶且能达到将纤维原料酶水解、固定化纤维二糖酶和固定化酵母细胞的作用祸合的三级串联式生物反应器同等效果。固定化细胞可以重复利用,连续十批反应中纤维素对乙醇的转化率平均为43.54%。这项研究结果对于简化工艺、减少设备、节约能耗、完善自动化控制等具有重要意义,这一研究成果不但在学术上具有明显的创新,而且对于整个可再生资源的转化利用具有重要的促进作用。

3.2分批添料式协同酶解发酵工艺

采用分批添料式协同酶解发酵工艺,可提高纤维素底物的终浓度和产物乙醇的终浓度。底物浓度最高可达250g/l,产物浓度最高可达66.51g/l。
利用纤维素原料生产乙醇的工艺中,纤维素酶的用量是决定生产成本的关键因素,分批添料发酵工艺,对于转化等量底物的酶用量和反应时间都明显减少,有效提高了酶的利用率和乙醇生产效率。本工作中的纤维素酶用量由原先的15IU/g降低到12.08IU/g底物,酶的利用率得到了一定的提高。
因此,利用分批添料式协同酶解发酵工艺,在不添加其它淀粉质原料的情况下,发酵水平可以达到酒精蒸馏的最低要求,形成了纤维素固相酶解与高浓度同步糖化发酵祸合新技术,该技术为纤维质原料生产乙醇的工业化奠定一定的基础。

3.3水稻秸秆资源的全利用

水稻秸秆由纤维素、半纤维素和木质素组成,具有高度不均一性。本研究中水稻秸秆纤维素通过二级串联式生物反应器高效转化为燃料乙醇,而其它组分则可能随之成为废弃物,造成环境污染的同时又导致资源浪费。利用水稻秸秆组分高效分离技术,半纤维素可用于生产低聚糖、生物农药等,木质素可用于生产木素碳纤维等高附加值产品。有机结合本研究二级串联式反应器水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇,有望达到水稻秸秆生态高值化全利用的目标。第八章结论
1筛选到一株高产纤维素酶的青霉菌株 (Penicillium)YT01,对其进行原生质体紫外诱变获得突变菌YTO2,对YT02液态发酵工艺条件进行了优化,发酵 1ZOh,滤纸酶活力(F队)达到 3.92IU/mL,高于目前纤维素酶工业生产菌株斜卧青霉和公认高产纤维素酶的里氏木霉,达到了国内先进水平。
2本实验采用YT02为生产菌株,选择廉价的水稻秸秆和豆饼粉为碳源和氮源,大幅度降低了生产成本。并首次将响应面分析法用于YT02产纤维素酶培养基组成的优化,取得了良好的效果。在培养基优化前滤纸酶活(FPA)、CMc酶活和β-葡萄糖苷酶活分别为3.92IU/mL、 228.47IU/mL和  1.36IU/mL,经优化后,上述酶活分别达到了 8.8967IU/mL、357.41IU/mL和  3.704IU/mL,均远高于优化前的水平。经响应面分析获得的优化培养基组成为:
水稻秸秆为 41.95g/L,豆饼粉为 24.53g/L,麸皮为22.16g/L,(NH4)2504、KHZpo;为4g/L,Mgso;为0.5g/l。研究结果在SL发酵罐中成功地得到了放大,滤纸酶活力(F队)高达11.13IU加L。为纤维素酶的工业化应用奠定了良好的基础。该工艺不仅可以变废为宝、减少环境污染,而且产酶水平高、经济效益明显。
3利用分子生物学方法构建了代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌NAN-28,NAN-28能在以纤维二糖为唯一碳源的培养基内快速生长,纤维素酶活测定也表明纤维二糖酶基因在NAN一28细胞中得到了活性表达,以纤维素水解液发酵实验也表明采用NAN-28可有效代谢纤维二糖和葡萄糖转化燃料乙醇,并能减少用酶量,简化工艺,降低成本。
4采用海藻酸钙凝胶包埋细胞可有效实现NAN-28细胞固定,在同时糖化发酵过程中,该方法比直接以游离细胞发酵更为经济简便,而且细胞浓度高,对纤维素酶解多相复杂系统的抗性明显增强,对乙醇催化效率高,且发酵性能稳定。本工作纤维素酶解实验中,与游离细胞相比,使用NAN-28固定化细胞发酵,乙醇得率提高了20%以上。这种新型的固定化细胞技术在学术研究和实际应用中都具有重要意义。
5利用高浓度固相酶解一固定化细胞发酵祸合的新型生物反应器,将纤维原料的酶水解、酿酒酵母工程菌代谢纤维二糖与固定化细胞连续酒精发酵的作用有机地祸联在二级串联124式生物反应器中,研究了祸合过程中底物浓度、纤维素酶浓度和温度分布等相互作用过程,新型祸合系统使固相酶解与酒精发酵分别在最适温度下进行,生物转化效率显著提高,同步进行的代谢纤维二糖酵母工程菌酒精发酵有效地消除了纤维二糖和葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用,促进了纤维原料的酶水解,纤维素对乙醇的转化率可达48.0%(理论转化率为56.1%)。采用分批添料式协同酶解发酵技术,可提高纤维底物的终浓度(200g/l)和产物乙醇终浓度达到53.8g/l,发酵周期为68h,对于转化等量底物而言,反应时间较一次加料工艺明显缩短。生产效率提高到0.79留(L·h),这种新型的生物反应器性能稳定、纤维素酶的利用率和燃料乙醇的生产效率高、产品的分离提取容易,是纤维素生物转化研究领域中的一项创新。




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